三硝基苯磺酸法（TNBS）测定蛋白质水解度？

TNBS法测定蛋白质水解度允许的测定范围是0.05-0.4umol氨基酸。本人以L-亮氨酸为标准物，绘制标准曲线结果很是不理想。
尝试一：L-亮氨酸标准液（5mmol/L）分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0（1ml时是超出本方法测定范围的，只是预想看一下 超出范围后显色反应上的差异，下同）ml+2mlpH8.2的磷酸buffer+1ml0.1%TNBS，避光水浴（40℃，120min）+2ml0.01mol/l亚硫酸钠溶液
尝试二：L-亮氨酸标准液（5mmol/L）分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml+2mlpH8.2的磷酸buffer+2ml0.1%TNBS，避光水浴（40℃，120min）+2ml0.01mol/l亚硫酸钠溶液
尝试三：L-亮氨酸标准液（5mmol/L）分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml+40g/L碳酸氢钠溶液+1ml0.1%TNBS，避光水浴（40℃，120min）+2ml0.01mol/l亚硫酸钠溶液；
尝试四：L-亮氨酸标准液（5mmol/L）分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml+40g/L碳酸氢钠溶液+1ml0.1%TNBS+2ml0.01mol/l亚硫酸钠溶液，避光水浴（40℃，120min）；
三种尝试，测定波长均为420nm。

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