蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南十

蛋白质纯化

RP-HPLC 是一种有效的蛋白质/多肽纯化工具。
通过 RP-HPLC 法可以从杂质中分离目标蛋白/多肽，采集到的片段可用于进一步研究，以及借助正交分析技术的分析，甚至可作为ZL药物。

在蛋白质/多肽分析过程中，色谱条件优化的目标是优化分辨率和保留时间。
制备色谱法分离蛋白质/多肽时，色谱条件的开发主要是三个参数的优化（参见图45）：

• 产量是从色谱法每一步中得到的纯化的目标蛋白/多肽含量。高产量可提高纯化过程的实用性，并降低成本。

• 纯度是从目标产物中去除杂质的程度。纯度高有助于从后续分析中获得更佳的数据或获得高纯度产物。

• 通量用来衡量制备周期中纯化的物质量。高通量说明在给定的成本和时间内获得更多研究或分析用物质，或更多原料药，用于制药领域。

由于制备色谱的目的与分析色谱的目的不同，因此色谱条件优化也不同。

图45. 在蛋白质或多肽的制备纯化中，通过寻求产量、纯度及通量的Z佳平衡实现分离条件的优化。

样品装载
在分析色谱中，将小样品装载到色谱柱上以确保加样量不影响分辨率。
如果样品量过高，则峰会加宽，进而分辨率会下降。
在不发生峰展宽的情况下允许加载到色谱柱的样品量（“样品容量”）取决于柱的大小（附录列表显示了柱的大小和样品容量）。
制备色谱法纯化蛋白质/多肽时，通常会超出样品容量，使柱“过载”，从而增加产量和通量（图46）。
当允许一定的分辨率损失时，加载的样品量可为样品容量的10~50倍（附录，Z大实际负载）。
图46中，尽管由于柱过载使得峰变宽，但峰形相对较好，说明严重过载在增加产量的同时还能保持纯度，但目标蛋白/多肽的损失不可避免。
由于样品过载，图47中峰也同样加宽。

片段收集、分析和利用
当柱过载时，通常会抛弃起始峰和结尾峰。
图46中，对红色区标示的峰的中间区域进行了收集。去掉了峰首和峰尾。
这避免了分离度较差的杂质峰的收集，增加了纯度，但降低了产量。
在制备色谱中，对几种感兴趣的峰进行了片段收集，用于杂质分析。   

图46.在多肽纯化示例中，制备分离包括柱的过载加样，以增加产量。
分辨率降低，为了增加纯度必须抛弃峰首和峰尾，但产量稍微有所降低。

基于分析结果，收集了少杂质或无杂质的片段，抛弃了峰首和峰尾附近杂质较多的片段。
收集和抛弃片段的选择应考虑纯度和产量的平衡。

例如，在不损失分辨率的情况下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于纯化少量多肽（Z多约200微克）。
但为了增加产量和通量，同样大小的柱Z多可纯化10毫克，但会有一定的纯度或产量损失。
恰当的收集峰选择有助于实现纯度和产量间的Z佳平衡。

在制备色谱中，尽管ZD在样品质量，但样品体积也可能会很大。
尽管可采用样品环和注射器，但通过将样品“泵”至柱上可以注入更多样品。
将泵的吸入管置于样品容器内，样品通过洗脱泵加载至色谱柱。
当有机溶剂浓度低（通常，样品装在水相中）且目的蛋白/多肽以有机溶剂梯度洗脱时，可通过这种方式装入大量样品。

吸附剂粒径
分析色谱常用的吸附剂粒径为5μm，制备色谱常用的吸附剂粒径更大。
尤其是加样量超过样品容量时（柱过载），柱效较分析色谱影响较小。
当柱过载时，大粒径填充柱同小粒径填充柱分离蛋白质和多肽的效果一样。
因此，制备色谱常用10μm或以上粒径的吸附剂。粒径分布也往往更宽。
不同于0.5μm或更窄的粒径分布范围，制备色谱的粒径范围更大，例如10~15μm。
由于制备色谱柱反压和成本更低，因此更倾向于采用大粒子。

柱内径
由于样品容量很低，纯化过程很少使用小孔柱（内径小于2mm）。
小规模实验室纯化采用细孔柱（内径约2mm）和分析柱（4.6 mm内径）。
这种小规模制备分离的色谱条件通常与分析分离的色谱条件相同。
需要大量蛋白质/多肽时，采用10mm和22mm内径的柱子。
1 mg蛋白质或多肽的纯化可采用10 mm柱子，5 mg纯化可采用22 mm柱子。
允许柱过载时，可纯化更多蛋白质/多肽，10mm柱Z多可纯化50mg，22mm柱Z多可纯化200mg。
大量蛋白质或多肽的纯化采用50 mm、100 mm或内径更大的大内径柱子。
50mm内径的柱上已知Z多可纯化5克蛋白质/多肽。

柱长
与分析柱相比，制备柱往往相对较短。
这是因为在制备色谱法中，柱的总体积比柱长更重要，特别是蛋白质的分离。
内径60cm、柱长12-15 cm（“圆饼状”柱）的色谱柱已应用到蛋白质ZL药物的大规模纯化中。
由于在制备色谱法中，柱通常过载，且效益的重要性远不及产量、纯度及通量重要，因此根据其实用性而非效益优化柱尺寸。

流动相组成
同分析色谱法一样，采用10~22mm内径柱的小规模纯化常用乙腈-TFA体系。
大规模纯化通常采用乙醇等溶剂替代乙腈，采用乙酸替代TFA。
尽管采用这些溶剂作流动相会降低分辨率，但它们更适合大规模使用，且分辨率的降低与柱过载固有的分辨率损失相同

蛋白质变性
通常认为反相色谱法会使蛋白质变性，因此洗脱出来的蛋白质不是天然蛋白，且可能不具备生物活性。
尽管反相HPLC的操作条件会使蛋白质变性，但洗脱后仍可获得天然、具有生物活性的蛋白质。
有机溶剂可能减弱疏水力，造成蛋白质三级结构的损失。吸附剂的疏水面也可能导致蛋白质的去折叠。
但与色谱分离时间相比，蛋白质去折叠通常较慢，且蛋白质在反相色谱分离期间仅发生轻微变性。
由于二硫键的作用，蛋白质保持球形结构，且仅发生部分去折叠，因此从反相柱洗脱出的蛋白质通常可通过在恰当的重折叠缓冲液中处理，从而恢复其天然结构而恢复至天然状态。
目前有许多实例均显示采用反相HPLC纯化后的蛋白仍维持天然三级结构和生物活性。
胰蛋白酶的反相纯化，其中活性得到了保留，且随后用于蛋白质的胰蛋白酶酶切。
重组人红细胞生成素是一种成功商业化的蛋白质ZL药物，采用了反相GX液相色谱法将蛋白药物从其细胞培养表达系统中分离出来。
采用反相HPLC对另一种商业蛋白质ZL药物——粒细胞刺激因子进行了纯化。
此外，还采用反相HPLC对重组人胰岛素进行了纯化，维持了活性结构。

纯化实例
图47显示了合成肽——促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂的纯化过程。该纯化过程通过以下几个步骤展开：

• 在4.6 x 250 mm 的分析柱上构建洗脱条件。

• 在50 x 300 mm 的柱上装载1.2克合成肽混合物，基于diyi步构建的条件洗脱（图47）。

• 对 GnRH 拮抗剂各洗脱峰的片段进行收集并借助分析法分析，Z终实现Z高产量和纯度。

• 用乙腈和TFA作为洗脱剂，在反相色谱柱上再次进行色谱分析,完成收集到片段的脱盐处理。

• 收集片段实现Z高产量和纯度。
  

在该色谱纯化步骤中，从1.2 gm的反应混合液中可收集128 mg的纯化肽。
该纯化过程采用了与分析色谱分离相同的有机溶剂——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。
由于柱过载，洗脱峰更宽，分辨率不如分析色谱。但峰仍然较为紧密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脱液。        

图47. 128mg的合成肽——促性腺激素释放激素的纯化。

柱严重过载，导致峰非常宽。

条件        

色谱柱：C18宽孔柱，15~20μm粒径，50 x 300 mm。

流动相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脱。

样品：促性腺激素释放激素