蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南十

蛋白质纯化

RP-HPLC 是一种有效的蛋白质/多肽纯化工具。
通过 RP-HPLC 法可以从杂质中分离目标蛋白/多肽，采集到的片段可用于进一步研究，以及借助正交分析技术的分析，甚至可作为ZL药物。

在蛋白质/多肽分析过程中，色谱条件优化的目标是优化分辨率和保留时间。
制备色谱法分离蛋白质/多肽时，色谱条件的开发主要是三个参数的优化（参见图45）：

• 产量是从色谱法每一步中得到的纯化的目标蛋白/多肽含量。高产量可提高纯化过程的实用性，并降低成本。

• 纯度是从目标产物中去除杂质的程度。纯度高有助于从后续分析中获得更佳的数据或获得高纯度产物。

• 通量用来衡量制备周期中纯化的物质量。高通量说明在给定的成本和时间内获得更多研究或分析用物质，或更多原料药，用于制药领域。

由于制备色谱的目的与分析色谱的目的不同，因此色谱条件优化也不同。

图45. 在蛋白质或多肽的制备纯化中，通过寻求产量、纯度及通量的Z佳平衡实现分离条件的优化。

样品装载
在分析色谱中，将小样品装载到色谱柱上以确保加样量不影响分辨率。
如果样品量过高，则峰会加宽，进而分辨率会下降。
在不发生峰展宽的情况下允许加载到色谱柱的样品量（“样品容量”）取决于柱的大小（附录列表显示了柱的大小和样品容量）。
制备色谱法纯化蛋白质/多肽时，通常会超出样品容量，使柱“过载”，从而增加产量和通量（图46）。
当允许一定的分辨率损失时，加载的样品量可为样品容量的10~50倍（附录，Z大实际负载）。
图46中，尽管由于柱过载使得峰变宽，但峰形相对较好，说明严重过载在增加产量的同时还能保持纯度，但目标蛋白/多肽的损失不可避免。
由于样品过载，图47中峰也同样加宽。

片段收集、分析和利用
当柱过载时，通常会抛弃起始峰和结尾峰。
图46中，对红色区标示的峰的中间区域进行了收集。去掉了峰首和峰尾。
这避免了分离度较差的杂质峰的收集，增加了纯度，但降低了产量。
在制备色谱中，对几种感兴趣的峰进行了片段收集，用于杂质分析。   

图46.在多肽纯化示例中，制备分离包括柱的过载加样，以增加产量。
分辨率降低，为了增加纯度必须抛弃峰首和峰尾，但产量稍微有所降低。

基于分析结果，收集了少杂质或无杂质的片段，抛弃了峰首和峰尾附近杂质较多的片段。
收集和抛弃片段的选择应考虑纯度和产量的平衡。

例如，在不损失分辨率的情况下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于纯化少量多肽（Z多约200微克）。
但为了增加产量和通量，同样大小的柱Z多可纯化10毫克，但会有一定的纯度或产量损失。
恰当的收集峰选择有助于实现纯度和产量间的Z佳平衡。

在制备色谱中，尽管ZD在样品质量，但样品体积也可能会很大。
尽管可采用样品环和注射器，但通过将样品“泵”至柱上可以注入更多样品。
将泵的吸入管置于样品容器内，样品通过洗脱泵加载至色谱柱。
当有机溶剂浓度低（通常，样品装在水相中）且目的蛋白/多肽以有机溶剂梯度洗脱时，可通过这种方式装入大量样品。

吸附剂粒径
分析色谱常用的吸附剂粒径为5μm，制备色谱常用的吸附剂粒径更大。
尤其是加样量超过样品容量时（柱过载），柱效较分析色谱影响较小。
当柱过载时，大粒径填充柱同小粒径填充柱分离蛋白质和多肽的效果一样。
因此，制备色谱常用10μm或以上粒径的吸附剂。粒径分布也往往更宽。
不同于0.5μm或更窄的粒径分布范围，制备色谱的粒径范围更大，例如10~15μm。
由于制备色谱柱反压和成本更低，因此更倾向于采用大粒子。

柱内径
由于样品容量很低，纯化过程很少使用小孔柱（内径小于2mm）。
小规模实验室纯化采用细孔柱（内径约2mm）和分析柱（4.6 mm内径）。
这种小规模制备分离的色谱条件通常与分析分离的色谱条件相同。
需要大量蛋白质/多肽时，采用10mm和22mm内径的柱子。
1 mg蛋白质或多肽的纯化可采用10 mm柱子，5 mg纯化可采用22 mm柱子。
允许柱过载时，可纯化更多蛋白质/多肽，10mm柱Z多可纯化50mg，22mm柱Z多可纯化200mg。
大量蛋白质或多肽的纯化采用50 mm、100 mm或内径更大的大内径柱子。
50mm内径的柱上已知Z多可纯化5克蛋白质/多肽。

柱长
与分析柱相比，制备柱往往相对较短。
这是因为在制备色谱法中，柱的总体积比柱长更重要，特别是蛋白质的分离。
内径60cm、柱长12-15 cm（“圆饼状”柱）的色谱柱已应用到蛋白质ZL药物的大规模纯化中。
由于在制备色谱法中，柱通常过载，且效益的重要性远不及产量、纯度及通量重要，因此根据其实用性而非效益优化柱尺寸。

流动相组成
同分析色谱法一样，采用10~22mm内径柱的小规模纯化常用乙腈-TFA体系。
大规模纯化通常采用乙醇等溶剂替代乙腈，采用乙酸替代TFA。
尽管采用这些溶剂作流动相会降低分辨率，但它们更适合大规模使用，且分辨率的降低与柱过载固有的分辨率损失相同

蛋白质变性
通常认为反相色谱法会使蛋白质变性，因此洗脱出来的蛋白质不是天然蛋白，且可能不具备生物活性。
尽管反相HPLC的操作条件会使蛋白质变性，但洗脱后仍可获得天然、具有生物活性的蛋白质。
有机溶剂可能减弱疏水力，造成蛋白质三级结构的损失。吸附剂的疏水面也可能导致蛋白质的去折叠。
但与色谱分离时间相比，蛋白质去折叠通常较慢，且蛋白质在反相色谱分离期间仅发生轻微变性。
由于二硫键的作用，蛋白质保持球形结构，且仅发生部分去折叠，因此从反相柱洗脱出的蛋白质通常可通过在恰当的重折叠缓冲液中处理，从而恢复其天然结构而恢复至天然状态。
目前有许多实例均显示采用反相HPLC纯化后的蛋白仍维持天然三级结构和生物活性。
胰蛋白酶的反相纯化，其中活性得到了保留，且随后用于蛋白质的胰蛋白酶酶切。
重组人红细胞生成素是一种成功商业化的蛋白质ZL药物，采用了反相GX液相色谱法将蛋白药物从其细胞培养表达系统中分离出来。
采用反相HPLC对另一种商业蛋白质ZL药物——粒细胞刺激因子进行了纯化。
此外，还采用反相HPLC对重组人胰岛素进行了纯化，维持了活性结构。

纯化实例
图47显示了合成肽——促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂的纯化过程。该纯化过程通过以下几个步骤展开：

• 在4.6 x 250 mm 的分析柱上构建洗脱条件。

• 在50 x 300 mm 的柱上装载1.2克合成肽混合物，基于diyi步构建的条件洗脱（图47）。

• 对 GnRH 拮抗剂各洗脱峰的片段进行收集并借助分析法分析，Z终实现Z高产量和纯度。

• 用乙腈和TFA作为洗脱剂，在反相色谱柱上再次进行色谱分析,完成收集到片段的脱盐处理。

• 收集片段实现Z高产量和纯度。
  

在该色谱纯化步骤中，从1.2 gm的反应混合液中可收集128 mg的纯化肽。
该纯化过程采用了与分析色谱分离相同的有机溶剂——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。
由于柱过载，洗脱峰更宽，分辨率不如分析色谱。但峰仍然较为紧密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脱液。        

图47. 128mg的合成肽——促性腺激素释放激素的纯化。

柱严重过载，导致峰非常宽。

条件        

色谱柱：C18宽孔柱，15~20μm粒径，50 x 300 mm。

流动相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脱。

样品：促性腺激素释放激素

引言

反相HPLC已成为分离和分析蛋白质和多肽的重要工具。

它在生物技术行业中被广泛应用于蛋白质类ZL产品的表征，以及这些产品和杂质的鉴定。

在通过质谱鉴定蛋白质之前，反相HPLC在从消化后的蛋白质组中分离多肽方面有着至关重要的作用。

它也被用于探索性研究中多种蛋白质和多肽的纯化，以及蛋白类ZL药物的大规模纯化。

反相HPLC灵敏、通用性强，还可与质谱等技术结合使用，在蛋白质研究中具有重要的地位。

此外，它还能够分离结构近乎相同的蛋白质，因而得到了广泛的应用。

正如牛、人和猪胰岛素变异体的分离过程所示（图1），反相HPLC能够分离非常相似的蛋白质。

牛胰岛素和人胰岛素仅有三个氨基酸的差别，也能够被完全分离开来。

牛胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为丙氨酸，第10位为缬氨酸，“b”链的第30位为丙氨酸。

而人胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为苏氨酸，第10位为异亮氨酸，“b”链的第30位为苏氨酸。

图1. 以RP-HPLC对紧密关联的胰岛素变异体进行分离

猪胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异（猪胰岛素的“b”链第30位为丙氨酸，人胰岛素该位置为苏氨酸），在基线即已分离。  

在另一个实例中，尽管兔胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异，即以苏氨酸取代了丝氨酸，但也同样得到了分离（参考文献1）。  

反相HPLC的高分离能力也被扩展应用到了多肽上。  

在图2中，两种多肽尽管只有一个氨基酸的差异，即丝氨酸对苏氨酸，但也得到了完全的分离。  

这种高分离能力是反相HPLC在蛋白质和多肽分离中得到广泛应用的基础性因素。  

图2. 以RP-HPLC对紧密关联的多肽进行分离。仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素，一种含丝氨酸，而另一种含苏氨酸。  

蛋白质/多肽的保留机制  

在反相HPLC中，颗粒表面是十分疏水的，因为其表面通过化学连接有羟基（图3中的波浪形红线）。  

通过疏水表面对蛋白质一面（被称为“疏水性足”）的吸附，蛋白质被保留下来（图3）。  

与疏水表面的厚度相比，蛋白质要大得多，因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。  

大部分蛋白质位于表面上方并与流动相接触。  

由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强，会导致蛋白质保持吸附在表面上（图4A），直至接触到特定浓度的有机溶剂，这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱（图4B）。  

在Z初的吸附/解吸附之后，尽管蛋白质在从色谱柱上移动下来时仍会与表面产生一些相互作用，但却是十分微弱的，对分离过程无影响。  

分离是由单次吸附/解吸附过程完成的。  

解吸蛋白质所需要的有机改性剂的浓度十分精确，并与疏水足的大小呈函数关系。  

详情请参阅参考文献3。  

图4. 进入色谱柱的蛋白质被吸附在柱顶端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有机改性剂的浓度达到特定值，此时蛋白质从表面解吸附（B）。  

在反相HPLC中，吸附/解吸保留机制导致蛋白质的保留行为与小分子不同。  

小分子的保留行为随着有机溶剂浓度的改变而缓慢改变时（图5，联苯），一旦有机溶剂的浓度达到所需要的值，蛋白质的保留行为即发生突然改变，引起保留时间的快速变化（图5，蛋白质）。  

该过程产生的尖锐峰形常见于蛋白质和多肽（图6A）。  

由于有机溶剂浓度的微小变化会引起的显著的保留行为变化，等度洗脱很少被用于蛋白质中，因为峰变宽了，而有机溶剂的微小改变会导致蛋白质保留行为的巨大变化（图6B）。

图5.有机溶剂浓度对应的保留行为  

图6.  

A. 梯度洗脱过程中多肽和蛋白质洗脱出尖锐峰形。  

B. 等度洗脱下，蛋白质的峰形（本例中为溶菌酶）很宽，有机溶剂的微小改变都会引起保留时间的巨大变化。  

蛋白质/多肽液相分析中的流动相选择

有机溶剂可将吸附在疏水界面的蛋白质洗脱（图14）。

在梯度洗脱期间，当有机溶剂量达到针对每一蛋白质的特定浓度时，蛋白质就会从疏水界面上解吸，继续顺着柱向下，从而从柱中洗脱。

图14. 当有机改性剂的浓度达到特定值时，蛋白质从疏水界面洗脱。


乙腈。在多肽的反相色谱分离时Z常用的有机溶剂为乙腈。为什么选择乙腈？

• 乙腈易挥发，易从样品中去除。

• 乙腈黏度低，柱压低。

• 乙腈的紫外吸收截止波长较短。

• 乙腈长期用于分离应用。

异丙醇。异丙醇在多肽的色谱分离中具有重要作用。尽管异丙醇黏度大（会增大柱压），很少单独用作有机改性剂，但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用，尤其是强疏水性蛋白。
在此类情况下，以1%~5%的恒定浓度加入异丙醇，以提高疏水性多肽的回收率或洗脱。

其它有机改性剂。很少使用甲醇或乙醇等有机改性剂，除非在分离强疏水性蛋白时。此外，由于乙醇毒性低，因此还用于蛋白质的大规模纯化。

梯度洗脱。多肽的洗脱几乎都采用梯度洗脱法，采用梯度洗脱法分离时，逐渐增大有机溶剂的相对浓度。
当有机改性剂的浓度升到解吸所需的特定浓度时，蛋白质和多肽就从柱上洗脱。如图15所示，有机改性剂的浓度（梯度）变化速率越慢，这些蛋白亚基的分辨率越高。
在该例中，相较于每分钟0.5%的梯度变化速率，每分钟0.25%的梯度变化显着提高了分辨率。
蛋白质/多肽的保留机制的图1中显示了采用每分钟0.15%的梯度变化速率时几种胰岛素的分离过程。采用每分钟0.05%的梯度变化速率洗脱时，分辨率Z大。

图15. 一般情况下，降低有机溶剂浓度变化速率会提高分辨率。

A.   细胞色素c亚基

B.   色谱图A中间片段的重现。

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

降低梯度变化速率增加分辨率时，所需的分析时间必须尽可能短。
但是，梯度变化速率的调整在优化蛋白质和多肽的分辨率方面非常重要。

有时，降低梯度变化速率时，多肽会表现出特异行为（图16）。
分辨率有时不会按照预期增加，反而会降低，导致出现共洗脱，甚至洗脱顺序也会颠倒。
在图16的示例中，洗脱时间为45分钟时多肽11和12表现出Z佳的分离效果。
当洗脱时间增加至90分钟时，多肽11和12间的分辨率降低；而当洗脱时间增加至160分钟时，出现共洗脱峰。
这种保留行为是多肽表面相互作用的结果，导致这种行为的原因目前尚不清楚。
因此，在进行多肽分离时，尤其是在分离蛋白酶水解物时，观察分辨率随梯度坡度降低的变化很重要。
如果分辨率未增加，反而降低，则必须优化梯度变化速率，以Z大化整体分辨率。

图16. 多肽间分辨率有时随着溶剂浓度变化速率的降低（洗脱时间增加）而降低。
这将导致分辨率降低或共洗脱峰的出现，如人生长激素肽图中多肽11和12例示。
在一些情况下，多肽甚至会逆转洗脱顺序。

样品人生长激素的胰蛋白酶水解物。部分显示了多肽图谱。

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 150 mm

洗脱液：梯度：0~60%乙腈与水溶性溶剂和0.1%TFA混合液和有机溶剂与0.08%TFA混合液在一定时间内形成梯度洗脱。

蛋白质和多肽的反相色谱分析法需要“离子对试剂”。
在流动相中加入离子对试剂，以实现良好的峰形。
目前认为，在没有离子对试剂的情况下，硅胶表面的金属杂质是导致蛋白质/多肽峰形较差的原因。

三氟乙酸。三氟乙酸（TFA）是Z常用的离子对试剂。将浓度为~0.1%的三氟乙酸加入流动相，会在大多数柱上产生良好的峰形（图17）。
降低TFA的浓度能提高LC-MS的检测灵敏度（见22~25页），但由于硅胶表面存在杂质，可能会导致硅胶柱上的峰形较差。
但采用高纯度硅胶柱时，可加入低浓度TFA（图17A——0.01% TFA）。

图17. TFA浓度对峰形和选择性的影响

洗脱液：加入如图所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为15分钟。
样品1.血管紧张素II 2.血管紧张素III3.血管紧张素I

其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是Z常用的离子对试剂，但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它试剂。

如图18所示，一些情况下，磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM，pH为2~2.5。此外，磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
尽管同TFA一样，磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低，但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH，为选择性和分辨率的改变提供了机会（见17页）。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是：磷酸盐不挥发，很难从肽中去除。

一些时候，七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂

图18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性

条件
色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脱液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:

1. 缓激肽

2. 神经降压素

3. 蛙皮素

4. 章鱼唾腺精

pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸，还是其它离子对试剂，用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低pH值条件下，羧酸基团——端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化，且仅有轻微极性。
将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化，减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值，但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（图19）。
与其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相pH的做法不经常采用，但它可以在一些特定情况下发挥作用。

图19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。

条件
色谱柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脱液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系，pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品

1. 血管紧张素II

2. 血管紧张素III

3. 血管紧张素I
   
   
   

流速。流动相的流速对反相GX液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示，流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时，胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加；体系压力可能会限制可用的流速。
此外，较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。

图20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化，总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。

条件
色谱柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脱液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系，时间、流速如图所示
样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物

灵敏的检测 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

利用反相GX液相色谱法分离多肽时，通常通过在214-215 nm波长附近的紫外吸收检测。
肽键在这一波长范围内吸收较好，为各类型多肽提供Z灵敏的检测。

采用短波紫外波段检测的一个问题是流动相的吸收。
在波长215 nm处，乙腈不吸收紫外光，但TFA会略有吸收。
在梯度洗脱期间，增加有机溶剂的浓度会使溶液的介电常数发生改变，这将引起TFA在短波紫外波段吸收光谱的变化。
这一吸光度变化会导致基线上飘，如图21所示。在需要灵敏检测时尤其明显。
在示例中，多肽图谱经常显示出基线飘高（图22）。避免基线漂移的常见做法是降低有机溶剂中TFA的浓度（相对于水溶性溶剂）。
如果在水溶性溶剂中加入0.1%的TFA，则在有机溶剂中加入0.08-0.09%的TFA。这将使多肽图谱中的基线趋平。

 
图21. 梯度洗脱期间，增加乙腈的浓度会改变流动相的介电常数，从而由于TFA吸收光谱的变化导致基线飘高。

图22. 随着有机溶剂浓度的增加，TFA吸收率变化可能引起多肽图谱中基线的漂移。

温度的影响 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

柱温和流动相温度会以两种方式影响多肽的分离。
随着温度上升，保留值会略微降低。
但更重要的是，肽对的相对保留值（选择性）取决于温度。
选择性随温度的变化影响分辨率，且在一系列多肽分离的优化中，温度是重要因素，如蛋白酶水解蛋白质期间产生的多肽。
温度在一系列合成肽分离中的作用如图23所示。
随着温度的增加，多肽保留值略有下降，但更重要的是，肽对间的分辨率随着温度的变化而变化。

因此，在多肽的分离中，控制柱温和流动相温度很重要。
此外，温度还是肽分离优化的重要变量，尤其是肽图谱中的分离。

温度会显着影响肽图谱中多肽的分离，如图24所示。
该示例为从人生长激素的胰蛋白酶水解物中分离多肽，增加柱温不仅影响肽的选择性，还会造成洗脱顺序的逆转。肽7和8在较高温度下的分辨率更高。
肽11~13的Z佳分离温度为40°C，温度提升至60℃会出现肽11和12的共洗脱峰。
肽14和15的Z适分离温度为20°C，肽15先出峰。
温度升至40℃时会使肽14先于肽15洗脱。
温度升至60℃时会提高肽14和15的分辨率。
在肽图谱中可以明显看出柱温对分辨率有显着的影响。

图23. 多肽保留值随着温度的增加而降低。更重要的是，温度影响相对保留值或选择性，进而影响分辨率。

条件

色谱柱：C8，2.1 x 150 mm

流动相：0~30% 乙腈—0.05% TFA体系，梯度洗脱，60分钟。

样品：合成螺旋多肽和非螺旋多肽

图24. 通常，蛋白水解产生多肽的相对保留值会受到温度的影响。

条件

色谱柱：C8宽孔柱，4.6 x 150 mm

流动相：0~60% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，60分钟。

样品：人生长激素的胰蛋白酶水解物

与多肽分辨率相比，蛋白质分辨率受温度的影响较小，但温度较高时，蛋白质的峰形和回收率均有所改善，特别是大分子蛋白或疏水性蛋白。
在环境温度下，单克隆抗体图谱的峰形较差，但当温度升高时，峰形会有明显改善（图25）。
通常在高温下用色谱法分析大分子蛋白或疏水性蛋白的效果Z佳。

图25.温度对反相GX液相色谱法（RP-HPLC）分析重组单克隆抗体的影响。

条件

色样品：重组单克隆抗体

谱柱：C8 宽孔柱，3.5 微米，4.6 x 150 mm

流动相：混合液梯度洗脱：20-90% 乙腈-0.1% TFA体系

蛋白质/多肽液相分析中的流动相选择

有机溶剂可将吸附在疏水界面的蛋白质洗脱（图14）。

在梯度洗脱期间，当有机溶剂量达到针对每一蛋白质的特定浓度时，蛋白质就会从疏水界面上解吸，继续顺着柱向下，从而从柱中洗脱。

图14. 当有机改性剂的浓度达到特定值时，蛋白质从疏水界面洗脱。


乙腈。在多肽的反相色谱分离时Z常用的有机溶剂为乙腈。为什么选择乙腈？

• 乙腈易挥发，易从样品中去除。

• 乙腈黏度低，柱压低。

• 乙腈的紫外吸收截止波长较短。

• 乙腈长期用于分离应用。

异丙醇。异丙醇在多肽的色谱分离中具有重要作用。尽管异丙醇黏度大（会增大柱压），很少单独用作有机改性剂，但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用，尤其是强疏水性蛋白。
在此类情况下，以1%~5%的恒定浓度加入异丙醇，以提高疏水性多肽的回收率或洗脱。

其它有机改性剂。很少使用甲醇或乙醇等有机改性剂，除非在分离强疏水性蛋白时。此外，由于乙醇毒性低，因此还用于蛋白质的大规模纯化。

梯度洗脱。多肽的洗脱几乎都采用梯度洗脱法，采用梯度洗脱法分离时，逐渐增大有机溶剂的相对浓度。
当有机改性剂的浓度升到解吸所需的特定浓度时，蛋白质和多肽就从柱上洗脱。如图15所示，有机改性剂的浓度（梯度）变化速率越慢，这些蛋白亚基的分辨率越高。
在该例中，相较于每分钟0.5%的梯度变化速率，每分钟0.25%的梯度变化显着提高了分辨率。
蛋白质/多肽的保留机制的图1中显示了采用每分钟0.15%的梯度变化速率时几种胰岛素的分离过程。采用每分钟0.05%的梯度变化速率洗脱时，分辨率Z大。

图15. 一般情况下，降低有机溶剂浓度变化速率会提高分辨率。

A.   细胞色素c亚基

B.   色谱图A中间片段的重现。

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

降低梯度变化速率增加分辨率时，所需的分析时间必须尽可能短。
但是，梯度变化速率的调整在优化蛋白质和多肽的分辨率方面非常重要。

有时，降低梯度变化速率时，多肽会表现出特异行为（图16）。
分辨率有时不会按照预期增加，反而会降低，导致出现共洗脱，甚至洗脱顺序也会颠倒。
在图16的示例中，洗脱时间为45分钟时多肽11和12表现出Z佳的分离效果。
当洗脱时间增加至90分钟时，多肽11和12间的分辨率降低；而当洗脱时间增加至160分钟时，出现共洗脱峰。
这种保留行为是多肽表面相互作用的结果，导致这种行为的原因目前尚不清楚。
因此，在进行多肽分离时，尤其是在分离蛋白酶水解物时，观察分辨率随梯度坡度降低的变化很重要。
如果分辨率未增加，反而降低，则必须优化梯度变化速率，以Z大化整体分辨率。

图16. 多肽间分辨率有时随着溶剂浓度变化速率的降低（洗脱时间增加）而降低。
这将导致分辨率降低或共洗脱峰的出现，如人生长激素肽图中多肽11和12例示。
在一些情况下，多肽甚至会逆转洗脱顺序。

样品人生长激素的胰蛋白酶水解物。部分显示了多肽图谱。

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 150 mm

洗脱液：梯度：0~60%乙腈与水溶性溶剂和0.1%TFA混合液和有机溶剂与0.08%TFA混合液在一定时间内形成梯度洗脱。

蛋白质和多肽的反相色谱分析法需要“离子对试剂”。
在流动相中加入离子对试剂，以实现良好的峰形。
目前认为，在没有离子对试剂的情况下，硅胶表面的金属杂质是导致蛋白质/多肽峰形较差的原因。

三氟乙酸。三氟乙酸（TFA）是Z常用的离子对试剂。将浓度为~0.1%的三氟乙酸加入流动相，会在大多数柱上产生良好的峰形（图17）。
降低TFA的浓度能提高LC-MS的检测灵敏度（见22~25页），但由于硅胶表面存在杂质，可能会导致硅胶柱上的峰形较差。
但采用高纯度硅胶柱时，可加入低浓度TFA（图17A——0.01% TFA）。

图17. TFA浓度对峰形和选择性的影响

洗脱液：加入如图所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为15分钟。
样品1.血管紧张素II 2.血管紧张素III3.血管紧张素I

其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是Z常用的离子对试剂，但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它试剂。

如图18所示，一些情况下，磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM，pH为2~2.5。此外，磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
尽管同TFA一样，磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低，但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH，为选择性和分辨率的改变提供了机会（见17页）。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是：磷酸盐不挥发，很难从肽中去除。

一些时候，七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂

图18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性

条件
色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脱液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:

1. 缓激肽

2. 神经降压素

3. 蛙皮素

4. 章鱼唾腺精

pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸，还是其它离子对试剂，用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低pH值条件下，羧酸基团——端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化，且仅有轻微极性。
将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化，减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值，但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（图19）。
与其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相pH的做法不经常采用，但它可以在一些特定情况下发挥作用。

图19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。

条件
色谱柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脱液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系，pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品

1. 血管紧张素II

2. 血管紧张素III

3. 血管紧张素I
   
   
   

流速。流动相的流速对反相GX液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示，流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时，胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加；体系压力可能会限制可用的流速。
此外，较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。

图20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化，总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。

条件
色谱柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脱液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系，时间、流速如图所示
样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物

肽图分析法 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

反相GX液相色谱已成为蛋白质分析和表征的标准方法，尤其是ZL性药物的分析和表征。
反相色谱分析法分辨率高，检测灵敏度好，能够提供大量关于蛋白质的信息。
有些时候，蛋白质作为完整的分子分析，但更多的时候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸残基将碳骨架断开，从而将蛋白质裂解成小片段。
随后用反相GX液相色谱法对裂解产生的肽段进行分析。
该技术叫作肽图分析，是一种标准的蛋白质分析方法。
通过反相色谱分析蛋白质裂解后的肽段能够获得蛋白质的大量信息。
通过比较表达蛋白与参照标准蛋白的肽图能够得出蛋白纯度和表达的准确性。肽图通常作为蛋白质ZL药物的鉴定分析工具。

• 通过肽图可以确定蛋白质降解产物，如发生脱酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。

• 肽图可以确认或验证二硫键连接，以此得出蛋白质三级结构和LX。

• 肽图能够确定糖基化（加入碳水化合物）位点，为详细鉴定连接在其上的寡糖提供了条件。

• 利用质谱检测得到的肽图为蛋白质鉴定、肽序列分析和数据确认提供了一种先进的手段。

在生物蛋白质组研究中，蛋白酶水解产物还用于蛋白质的鉴定和定量分析。

有许多蛋白水解酶都能断开蛋白质的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸残基。包括：

 胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下为胰蛋白酶水解蛋白的五个阶段：（注：参考文献21详细回顾了胰蛋白酶的水解）

1. 变性。要在合理的时间内完成蛋白质水解，必须对蛋白质作变性处理。高温下（37℃），将蛋白质置于6M 盐酸胍或8M 尿素等离液剂中，在中性pH值（~7.5）缓冲液下处理30分钟，蛋白质即可变性。

2. 二硫键的还原。二硫键会阻止蛋白质的完全变性。
   通常可通过在待水解蛋白的变性过程中加入浓度为~20 mM 的二硫苏糖醇（DTT）等还原剂将二硫键还原。

3. 游离半胱氨酸的羧甲基化。如果还原性半胱氨酸保持游离状态，则有可能以错误的方式重新形成二硫键。
   为了避免这种情况，可加入浓度为~60mM的碘乙酸等试剂，在37℃温度下处理30分钟，使游离半胱氨酸甲基化。该反应由100 mM DTT 退火。

4. 脱盐。当溶液中存在尿素或胍盐时，水解反应无法进行，因为胰蛋白酶自身作为一种蛋白质会变性，失去酶活性。
   尿素或胍盐必须通过离子交换或渗析去除或将浓度降低至1M以下。

5. 胰蛋白酶水解。脱盐后，将蛋白质溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的Z高活性pH）的缓冲液中——Tris或碳酸铵，并在20~100个待水解蛋白组分中加入一份胰蛋白酶，随后在低温至37℃的温度区间内处理蛋白质。
   低温处理时间长达16个小时。在37℃下，水解可在1~4小时内完成，具体取决于蛋白质。
   如果胰蛋白酶的时间、温度或相对浓度均过低，则水解将不完全，一些潜在裂解可能不发生，Z终导致形成含赖氨酸或精氨酸的大分子肽。
   如果胰蛋白酶的水解时间、温度或浓度均过高，则会发生胰蛋白酶自身溶解，产生“自溶产物”，即胰蛋白酶水解产生的肽段，从而造成混淆。
   惯常的做法是忽略蛋白质，考虑胰蛋白酶。按照蛋白质完全水解的条件对得到的样品进行色谱分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽图中任何胰蛋白酶自溶肽产物的位置。
   开发胰蛋白酶水解协议过程中，对胰蛋白酶和蛋白质的水解时间、温度和相对浓度进行了优化。
   当利用肽图确定二硫键的位置时，必须在不还原二硫键的情况下水解蛋白。但在二硫键未被还原的情况下，许多蛋白质的水解速度非常慢。
   在缺还原剂的情况下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，维持水解过程中蛋白质的变性。
   水解过程中有时采用表面活性剂维持溶液中的蛋白质，但表面活性剂会降低色谱分辨率，应尽量避免。

胰蛋白酶水解分析。蛋白质水解产生的肽段利用反相GX液相色谱分析，流动相采用含TFA体系（参见第15-17页），以起始浓度约5%的乙腈梯度洗脱（乙腈起始浓度低于5%可能导致较早洗脱出肽的色谱的不可重现性），乙腈浓度逐渐升至70%（参见图31）。
梯度洗脱的时间取决于待水解蛋白的大小。
大分子蛋白比小分子蛋白水解产生更多的肽段，因此肽段的分离需要更长洗脱时间。
小分子蛋白（小于20kd）水解产生的肽通常可在45~60分钟内完成分离。
大分子蛋白（20-50kd）需要较长的洗脱时间，一般为60~120分钟。
分子量大于50kd的蛋白质需要120~180分钟的洗脱时间。
采用1~2 ml/min 的流速和适宜的温度时分辨率Z佳。
通常采用C18 反相柱。可以使用孔径为100埃或300埃的柱子，其选择性通常不同。

图31. 牛血清白蛋白的肽图

色谱柱：ACE 5 C18-300 宽孔柱，4.6 x 150 mm

流动相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 体系，混合梯度洗脱120分钟。

 
蛋白质修饰引起肽保留时间的变化。如果蛋白质因翻译或表达错误，降解（脱酰胺作用、氧化反应）或过程变异而改变，则这种改变将会反映在一种或多种肽段。
由于与肽的反相相互作用的灵敏度，肽的任何变化都将导致该肽保留时间的变化。
在图32示例中，相差一个氨基酸的两种十肽，其中一个为苏氨酸，另一个为丝氨酸，在反相HPLC图谱中出现了两个峰。
不仅仅是一个氨基酸的差别，而且两种氨基酸均为羟基氨基酸，它们的不同之处在于苏氨酸侧链上加了一个甲基。
这说明了蛋白质的任何变化都会反映为肽的变化，从而导致该肽保留时间的改变。
肽图分析的本质是反相HPLC能够实现差别细微的多肽的分离。

图32. 以RP-HPLC对紧密关联的肽类进行分离。
仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素，一种含丝氨酸，而另一种含苏氨酸。

条件

色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脱液：

A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液

B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液

梯度：0 - 35%的B溶液超过73分钟

试样肽图与参照蛋白质肽图的比较。肽图能够提供有关蛋白质的很多信息。
惯常做法是对试样的肽图和参照蛋白质的肽图进行比较。
图33对重组人生长激素（在大肠杆菌中表达）的肽图和天然人生长激素（缺乏甲硫氨酸）的肽图进行了比较。
由于甲硫氨酸的疏水性质，重组人生长激素比天然人生长激素较晚洗脱出来。
在这个例子中，为了便于比较，将第二幅图谱倒置显示。
在一些情况下，为了确认微小的变化和证明分析工具与肽图的变化无关，会将两种水解产物混合进行色谱分析。

肽图比较揭示了蛋白质的改变和修饰，如：基因改变、翻译错误、蛋白降解（脱酰胺作用、氧化反应），以及翻译后修饰的改变。

图33. 重组人生长激素和天然人生长激素（缺乏甲硫氨酸）肽图的比较。

条件：

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 150 mm

流动相：0~70% 乙腈-0.1% TFA 体系梯度洗脱

蛋白质氧化 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

在氧化环境条件下，尽管蛋白质的几个氨基酸都可能受影响，但Z有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亚砜（图34）。
对甲硫氨酸残基的氧化取决于其在蛋白质中的位置。埋藏在蛋白质内部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且与溶剂接触的甲硫氨酸侧链Z有可能被氧化。
氧化条件包括热、过渡金属的存在以及溶液中氧气的存在。
同脱酰胺作用一样，甲硫氨酸的氧化可能导致生物活性的丧失或减弱，或者，在一些情况下对生物活性无影响。
这取决于甲硫氨酸在蛋白质中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亚砜的存在说明蛋白质经受过氧化条件，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白质经受过胁迫条件。 

图34. 在氧化环境条件下，甲硫氨酸被氧化为甲硫氨酸亚砜。

图35. 天然蛋白水解产生的重组人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色谱法分离。

条件

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：37~47% 乙腈-0.1% TFA体系，30分钟梯度洗脱。

样品：被过氧化氢部分氧化的重组人凝血因子 VIIa。

通常会监测蛋白质ZL药物的氧化反应，因为它既可能影响生物活性，也可作为一种指示。
甲硫氨酸的氧化反应会导致蛋白质疏水性下降，因此在反相HPLC中，氧化蛋白会先于天然蛋白洗脱出来，如图35所示。
重组人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被过氧化氢部分氧化后利用反相HPLC对溶液进行分析。
氧化蛋白（两个甲硫氨酸残基被氧化）先洗脱出来。
只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白随后洗脱出来，Z后是天然蛋白。四种蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白间分辨率很高。这几种蛋白均有一个氧化甲硫氨酸，仅区别于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽图监测甲硫氨酸的氧化。
如图36所示，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰时间早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脱出来；T11 metox先于天然 T11洗脱出来，使得鉴别和监测更容易。

图36. 部分氧化的人生长激素的肽图。

条件

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 250 mm

流动相：0~40% 乙腈—0.1% TFA体系，梯度洗脱，120分钟。

脱酰胺作用 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

蛋白质在高温或高pH值下会降解。
在胁迫条件下，Z有可能发生的化学降解是酰胺侧链上的天冬酰胺转变为天冬氨酸或异天冬氨酸（图37)。
天冬酰胺脱去酰氨基时，许多蛋白都会失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影响。
即使脱酰胺作用不造成生物活性的减弱，脱酰胺作用也是蛋白接触不利条件的指示。
特定天冬酰胺残基脱酰胺的可能性取决于其在蛋白质三级结构中的位置。
只有那些与溶剂接触表面接近的天冬酰胺残基才会发生脱酰胺作用。
相邻的氨基酸残基同样影响脱酰胺作用的可能性。与天冬酰胺相邻的甘氨酸极大地增加了脱酰胺作用的可能性。
与天冬酰胺相邻的亮氨酸和异亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脱酰胺作用的可能性。
由于脱酰胺作用会影响生物活性并能指示不利条件，因此惯常的做法是监测蛋白质ZL药物中天冬酰胺的脱酰胺作用。

图37. 当酰胺侧链暴露在高温和/或高pH条件下时，天冬酰胺转化为天冬氨酸。

图38. 人生长激素脱酰胺作用的反相色谱分析

条件

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：29% 异丙醇，71% 10 mM Tris盐酸缓冲液、pH=7.5

这通常由反相GX液相色谱法实现。
图38显示了通过完整蛋白分子的反相色谱法测量人生长激素的脱酰胺作用的一个试验。
该试验pH为7.5，以使脱酰胺作用产生的天冬氨酸电离。
这使得脱酰胺的生长激素相较于天然蛋白疏水性减弱，从而比天然蛋白先洗脱出来。

更常见的一种方法是通过肽图中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留时间来测定脱酰胺作用。
在pH为2的肽图中，含有天冬氨酸的脱酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略强，因此比天然肽略晚洗脱出来，如图39所示。
脱酰胺肽容易鉴别测定，为脱酰胺作用的判定提供了较好的方法。

图39. 部分脱酰胺的核糖核酸酶的肽图

条件

色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，100分钟。

有时，脱酰胺肽较难从天然肽中分离或会在肽图中出现与其它肽的共洗脱峰。
如果分辨率不足，则可以增加pH。
如图40所示，在低pH值下分离较差的脱酰胺肽能够在6.5的高PH值下从天然肽中有效分离。
在部分脱酰胺的人生长激素的低pH肽图中（图40A），脱酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但与肽图中的另一种肽未分离。
对肽峰进行收集后以更高的pH（pH6.5）重新进行色谱分离。在高pH值下，脱酰胺肽中的天冬氨酸被电离，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（图40B）。

图40. 部分脱酰胺的人生长激素的肽图中脱酰胺肽从天然肽的分离。

A pH=2时，部分脱酰胺的hGH的肽图（0.1% TFA）

B 收集含天然肽（顶部）和脱酰胺肽（底部）的肽图A中的肽段，在6.5的pH下重新进行色谱分析。

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

二硫键测定

蛋白质依靠正确的二硫键键合维持其三级结构和生物活性。

如果二硫键被还原或交换，则蛋白质会失去天然三级结构和生物活性。

HPLC保留值取决于蛋白质“疏水脚”的大小（图41），它会受到三级结构的影响。

二硫键的改变通常会使“疏水脚”增大，从而使蛋白质在反相HPLC中的保留值增大。

图42中，天然白细胞介素II的出峰远远早于被还原的白细胞介素II，这是由于当二硫键被还原时，蛋白质的三级结构发生了改变。

图41. 蛋白质保留值取决于“疏水脚”的大小。被还原的二硫键会使蛋白结构发生部分变性，这将增大“疏水脚”和反相保留值。

图42. 随着二硫键的还原，白细胞介素II的“疏水脚”会增大，从而增加蛋白质在反相HPLC上的保留值。

条件

色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速进行90分钟的梯度洗脱

样品：白细胞介素II突变蛋白质

图43. 对二硫键合正常和发生二硫键交换的类胰岛素生长因子的分离。

条件

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：20~38% 乙腈：异丙醇（88:12）—0.1% TFA体系，梯度洗脱，27分钟。

即使是细微的二硫键改变也足以对疏水脚产生影响，从而改变保留值。
天然类胰岛素生长因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之间都有二硫键（图43A红色部分所示）。
经过36小时的空气氧化，一些IGF蛋白分子内出现了二硫键交换，变成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6间的二硫键键合（图43A蓝色部分）。
发生了二硫键交换的IGF比天然IGF出峰晚（图43），表明了疏水脚的增大。
天然蛋白的反相色谱法通常以反相保留值的变化揭示二硫键或蛋白三级结构的改变。

在蛋白酶水解蛋白过程中（通过省去DTT和羧甲基化过程），如果二硫键未被还原，则肽图中仍会包含二硫键合的二肽。
分别比较二硫键未还原和还原的肽图能够确定二硫键的位置。
在二硫键还原和未还原条件下水解白细胞介素II，通过RP-HPLC法得到两种水解产物的肽图（图44）。
图44A中，以T7+T10标记出的肽是一种二硫键合的二肽。
在二硫键被还原的条件下得到的肽图显示了两种肽，分别为T7和T10（图44B）。
这证实了二硫键存在于这两种肽之间。
监测蛋白质水解产物肽能够确定各个二硫键在蛋白质中的位置。
如果一个胰蛋白酶肽段内存在两个半胱氨酸，则必须利用另一种蛋白酶确定参与到二硫键中的半胱氨酸。

通常将肽图分析和质谱法联用确定二硫键的位置和状态。

图44. 分别比较二硫键未还原（A图）和还原（B图）情况下白细胞介素II的肽图。

条件

色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：5~80% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，99分钟。

样品：

A二硫键未还原情况下白细胞介素II的肽图。

B二硫键还原情况下白细胞介素II的肽图。