蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南七

蛋白质氧化 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

在氧化环境条件下，尽管蛋白质的几个氨基酸都可能受影响，但Z有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亚砜（图34）。
对甲硫氨酸残基的氧化取决于其在蛋白质中的位置。埋藏在蛋白质内部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且与溶剂接触的甲硫氨酸侧链Z有可能被氧化。
氧化条件包括热、过渡金属的存在以及溶液中氧气的存在。
同脱酰胺作用一样，甲硫氨酸的氧化可能导致生物活性的丧失或减弱，或者，在一些情况下对生物活性无影响。
这取决于甲硫氨酸在蛋白质中的位置。但另一方面，甲硫氨酸亚砜的存在说明蛋白质经受过氧化条件，因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白质经受过胁迫条件。 

图34. 在氧化环境条件下，甲硫氨酸被氧化为甲硫氨酸亚砜。

图35. 天然蛋白水解产生的重组人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色谱法分离。

条件

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

流动相：37~47% 乙腈-0.1% TFA体系，30分钟梯度洗脱。

样品：被过氧化氢部分氧化的重组人凝血因子 VIIa。

通常会监测蛋白质ZL药物的氧化反应，因为它既可能影响生物活性，也可作为一种指示。
甲硫氨酸的氧化反应会导致蛋白质疏水性下降，因此在反相HPLC中，氧化蛋白会先于天然蛋白洗脱出来，如图35所示。
重组人凝血因子VIIa（rCF VIIa）被过氧化氢部分氧化后利用反相HPLC对溶液进行分析。
氧化蛋白（两个甲硫氨酸残基被氧化）先洗脱出来。
只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白随后洗脱出来，Z后是天然蛋白。四种蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白间分辨率很高。这几种蛋白均有一个氧化甲硫氨酸，仅区别于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽图监测甲硫氨酸的氧化。
如图36所示，含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰时间早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脱出来；T11 metox先于天然 T11洗脱出来，使得鉴别和监测更容易。

图36. 部分氧化的人生长激素的肽图。

条件

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 250 mm

流动相：0~40% 乙腈—0.1% TFA体系，梯度洗脱，120分钟。