蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南四

灵敏的检测 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

利用反相GX液相色谱法分离多肽时，通常通过在214-215 nm波长附近的紫外吸收检测。
肽键在这一波长范围内吸收较好，为各类型多肽提供Z灵敏的检测。

采用短波紫外波段检测的一个问题是流动相的吸收。
在波长215 nm处，乙腈不吸收紫外光，但TFA会略有吸收。
在梯度洗脱期间，增加有机溶剂的浓度会使溶液的介电常数发生改变，这将引起TFA在短波紫外波段吸收光谱的变化。
这一吸光度变化会导致基线上飘，如图21所示。在需要灵敏检测时尤其明显。
在示例中，多肽图谱经常显示出基线飘高（图22）。避免基线漂移的常见做法是降低有机溶剂中TFA的浓度（相对于水溶性溶剂）。
如果在水溶性溶剂中加入0.1%的TFA，则在有机溶剂中加入0.08-0.09%的TFA。这将使多肽图谱中的基线趋平。

 
图21. 梯度洗脱期间，增加乙腈的浓度会改变流动相的介电常数，从而由于TFA吸收光谱的变化导致基线飘高。

图22. 随着有机溶剂浓度的增加，TFA吸收率变化可能引起多肽图谱中基线的漂移。

温度的影响 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南

柱温和流动相温度会以两种方式影响多肽的分离。
随着温度上升，保留值会略微降低。
但更重要的是，肽对的相对保留值（选择性）取决于温度。
选择性随温度的变化影响分辨率，且在一系列多肽分离的优化中，温度是重要因素，如蛋白酶水解蛋白质期间产生的多肽。
温度在一系列合成肽分离中的作用如图23所示。
随着温度的增加，多肽保留值略有下降，但更重要的是，肽对间的分辨率随着温度的变化而变化。

因此，在多肽的分离中，控制柱温和流动相温度很重要。
此外，温度还是肽分离优化的重要变量，尤其是肽图谱中的分离。

温度会显着影响肽图谱中多肽的分离，如图24所示。
该示例为从人生长激素的胰蛋白酶水解物中分离多肽，增加柱温不仅影响肽的选择性，还会造成洗脱顺序的逆转。肽7和8在较高温度下的分辨率更高。
肽11~13的Z佳分离温度为40°C，温度提升至60℃会出现肽11和12的共洗脱峰。
肽14和15的Z适分离温度为20°C，肽15先出峰。
温度升至40℃时会使肽14先于肽15洗脱。
温度升至60℃时会提高肽14和15的分辨率。
在肽图谱中可以明显看出柱温对分辨率有显着的影响。

图23. 多肽保留值随着温度的增加而降低。更重要的是，温度影响相对保留值或选择性，进而影响分辨率。

条件

色谱柱：C8，2.1 x 150 mm

流动相：0~30% 乙腈—0.05% TFA体系，梯度洗脱，60分钟。

样品：合成螺旋多肽和非螺旋多肽

图24. 通常，蛋白水解产生多肽的相对保留值会受到温度的影响。

条件

色谱柱：C8宽孔柱，4.6 x 150 mm

流动相：0~60% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，60分钟。

样品：人生长激素的胰蛋白酶水解物

与多肽分辨率相比，蛋白质分辨率受温度的影响较小，但温度较高时，蛋白质的峰形和回收率均有所改善，特别是大分子蛋白或疏水性蛋白。
在环境温度下，单克隆抗体图谱的峰形较差，但当温度升高时，峰形会有明显改善（图25）。
通常在高温下用色谱法分析大分子蛋白或疏水性蛋白的效果Z佳。

图25.温度对反相GX液相色谱法（RP-HPLC）分析重组单克隆抗体的影响。

条件

色样品：重组单克隆抗体

谱柱：C8 宽孔柱，3.5 微米，4.6 x 150 mm

流动相：混合液梯度洗脱：20-90% 乙腈-0.1% TFA体系