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典型的反相键合相色谱仪是采用非极性键合相和极性流动相组成的色谱体系，固定相常用十八烷基（ODS或C18）键合相，流动相常用甲醇－水或乙腈－水。非典型反相键合相色谱仪是采用弱极性或中等极性键合相和极性大于固定相的流动相组成的色谱体系。反相键合相表面具有非极性烷基官能团和未被取代的硅醇基，硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡视覆盖率而定。目前，还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
一、分配色谱的分离机制：
分配色谱的分离机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
二、吸附色谱的分离机制：
吸附色谱的分离机制可用疏溶剂理论解释。疏溶剂理论把非极性烷基键合相看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的分子毛，分子毛具有强疏水特性。当用水和有机溶剂组成的极性溶剂为流动相分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基产生缔合作用，使组分分子在固定相上得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用而离开固定相，保留值减小，此即解缔过程。这两种作用力之差决定了组分分子在色谱中的保留行为。
一般来说，固定相上的烷基配合基或组分分子中非极性部分的表面积越大或流动相表面张力和介电常数越大，缔合作用越强，分配比k越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
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