蛋白表达纯化实验流程

利用pFastBac1进行目的蛋白的表达的时候，根据蛋白纯化方式的需要以及融合表达目的蛋白以提高其表达量的需要，可以在质粒构建时添加His标签或GST标签。为了防止额外添加的His和GST等蛋白标签影响目的蛋白的生物学功能和结构研究，可在融合蛋白和标签之间添加蛋白酶酶切位点，如TEV或PreScission的酶切位点。如果蛋白主要以可溶形式表达，离心收集昆虫细胞，超声裂解细胞，但由于昆虫细胞内蛋白酶种类比较多，需要添加各种蛋白酶抑制剂。离心收集超声后上清，使用镍柱或GST柱等纯化目的蛋白。同时可以利用离子交换、分子筛层析等进一步纯化目的蛋白。纯化获得的蛋白，可以添加适量甘油后保存，或者如果有需要也可以适当浓缩后保存等。

蛋白表达纯化详细步骤：

一、杆状病毒制备与鉴定

培养昆虫细胞至密度达到5×106~1×107活细胞/ml，活性≥90%。用培养基将细胞稀释成2.5×106活细胞/ml 稀释液，27℃、127 r/min 恢复25 min。用Opti⁃MEMTMI 无血清培养基稀释 ExpiFectamineTMSf 转染试剂，并加入 Bacmid DNA（pc1⁃mfp5以及gus），室温孵育5 min，随后滴加到100 ml细胞稀释液中。27℃、127 r/min孵育72~96 h至细胞存活率降至 60%~80%，300×g 离心 5 min，保留上清即P0代病毒。

使用 ExpiSfTMCD 培养基制备连续 10 倍的病毒稀释液（10-2、10-3、10-4、10-5），并在培养基中将细胞稀释至1.25×106活细胞/ml。将1 ml 病毒稀释液添加到24深孔板中（每个稀释液1孔），随后将1 ml ExpiSfTMCD培养基添加到无病毒的阴性对照中。将800 μl细胞悬液添加到8个病毒稀释液以及阴性对照孔中，并在27℃、227 r/min 摇床中避光孵育14~16 h。将24深孔板中细胞分别取出，300×g离心5 min，弃上清。细胞沉淀重悬于100 μl 稀释的gp64APC抗体中，涡旋 3~5 s，室温孵育 30 min，PBS洗涤后重悬于1 ml胎牛血清稀释液中，通过流式细胞仪进行鉴定。

二、蛋白表达与鉴定

培养细胞至细胞密度达到 5×106~1×107活细胞/ml，活性≥90%，用培养基稀释至最终密度为5×106活细胞/ml，立即加入ExpiSfTM转染增强剂，在127 r/min，27℃摇床上孵育18~24 h。当细胞密度恢复至5×106~7×106活细胞/ml，活性≥80%时分别使用病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI，平均每个细胞的病毒感染数）30、60 以及 120的杆状病毒感染细胞，27℃、127 r/min培养直至细胞活性降至30%以下，300×g离心5min取上清。取200 μl细胞上清液以及细胞裂解液分别加入50 μl 5×SDS缓冲液，沸水煮6 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在90 V、90 min的状态下电转至醋酸纤维膜上。5% 脱脂奶粉封闭1 h，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证目的蛋白的表达情况”，纯化之后还可以通过SDS-PAGE验证，结合灰度分析验证蛋白的纯度

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