诱导表达实验流程

一、Mut+ 和Muts 表型的判断

待转化子在平板上生长一段时间后，进行Mut+ 和Muts 的筛选。挑取单克隆，在MM 及MD 培养基上划线或点（先在MM 平板上点，再在MD 平板上点，一个克隆换一次牙签），30℃培养2 天。观察，在MD 培养基上生长而在MM 培养基上不生长或长的很小即为Muts 表型，其余为Mut+ 表型。

二、Mut+表型重组酵母的诱导表达实验

1挑选一单菌落，置于装有25 mI MGY、BMG或BMGY 培养基的250 ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm 培养至OD600为2-6（16-18 h）；

2.室温下1500-3000g 离心5 min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右；

3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30 ℃/250-300 rpm 的摇床上继续生长;

4.每24 h向培养基中添加100% 甲醇至终浓度为 0.5-1.0%;

5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1 ml，置于1.5 ml EP 管中，转速离心2-3 min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间，时间点一般取:0、6、12、24、36、48、60、72、84和96 h；

6.对分泌表达，分离样品的上清液，对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80 ℃保存备用；

7.可以用SDS-PAGE、Westemm-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

三、Muts 表型重组酵母的诱导表达实验

1.挑选一单菌落，置于装有25 ml MGY、BMG或BMGY培养基的250 ml摇瓶中，于28-30 ℃/250-300 rpm 培养至OD600=2-6（16-18 h）；

2.室温下1500-3000g 离心5 min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM、BMM或BMMY重悬菌体(约10-20 ml)

3.将步骤 2 所得的菌液置于100 ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm 的摇床上继续生长;

4.每24h向培养基中添加100% 甲醇至终浓度为 0.5-1.0%;

5.按时间点分别取菌液样品，取样量为 1 ml，置于1.5 ml EP 管中，转速离心 2-3 min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间，时间点一般取：0、24、48、72、96和120 h；

6.对分泌表达，分离样品的上清液:对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，检测样品用液氨或干冰速冻后，于-80 ℃保存备用:

7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达

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