ibidi科普知识系列|伤口愈合细胞迁移实验小常识

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

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4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

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 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

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开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

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8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

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使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

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