SPE经典案例分析——在方法偏离的情况下如何对实验过程进行有效优化

大家好，

又到了我们每周一的干货时间。

大家还记得第yi期干货

如何解决在SPE操作时遇到流速慢的问题吗？

文中仔细分析了在SPE的基本操作阶段中

引发流速慢这类问题的主要原因。

今天我们主要给大家分享一下，

在方法偏离的情况下,

如何对实验过程进行有效优化。

在实验过程中，我们经常遇到方法偏离。方法偏离主要是发生在人机料法环测这几个方面。实验中经常遇到的样品量不同，前处理仪器不同这些都是很常见的偏离问题。那么在面对这样的问题的时候，我们该怎样对于整个样品前处理过程的产生一个合理分析并对实验步骤进行有效的优化调整呢？

今天我们给大家分享一个案例，通过这个案例，希望对您的实验有所启发。

这个案例来自我们的客户A。客户A是做雪碧里合成着色剂检测。参考标准是GB 5009.35-2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》。这个标准适用于饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂的测定，标准中用聚酰胺粉末吸附法或液液萃取分配法提取食品中人工合成着色剂，将其制成水溶液，再用高xiao液相色谱仪分析。这个国标的检测方法比较繁琐，并且赤藓红不能与其他色素一起测定，应用到实际检测时，很多老师都觉得实验过程过于复杂，难于操作。

针对这个国标，安谱实验对其方法进行了优化，并且成功开发了食品中合成着色剂检测专用小柱。采用高xiao液相色谱法来同时检测食品中8种合成着色剂（苋菜红、新红、赤藓红、胭脂红、日落黄、柠檬黄、亮蓝，靛蓝），方法简单易行，且回收率高，深受广大用户的欢迎。

案例中的客户A就是使用安谱实验的合成着色剂专用小柱（SBEQ-CA73-GBT5009.35）来实验的。客户在20g的雪碧样品里面加20ul,1000ug/ml的色素混标，采用全自动固相萃取仪按照安谱实验合成着色剂专用柱的实验方法中SPE的洗脱程序运行，结果发现亮蓝在的回收率不佳。客户希望我们能帮忙优化下实验方法。

面对客户对实验步骤优化的诉求，我们仔细分析了客户目前的实验方法。

根据表格中两种方法的对比，可以看出客户和安谱实验合成着色剂专用柱方法主要不同点是样品量不同而带来的。一是客户是按照国标的取样要求，需要20g的样品。而我们实验单页的样品取样量则为1g，具体到上样量，客户的上样量是约23ml，而我们的上样量约12ml。客户的上样量约为我们的2倍，二是客户的淋洗液和洗脱液也根据上样量而都扩大了2倍。最hou就是客户是用自动固相萃取装置进行SPE操作的，和手动的固相萃取方法在流速控制上还是有差异的。由此可见，客户的方法偏离主要体现在样品取样量，溶剂体积以及所用的仪器上。

客户反馈实验结果亮蓝的回收率不佳，希望能够改善亮蓝的回收率。针对客户的诉求，我们应该有如下思路来解决这个回收率的问题。

1  确定目标化合物主要损失步骤

亮蓝的回收率不佳，说明亮蓝在洗脱前的实验过程中有损失。针对这种情况，我们需要先确定亮蓝的主要损失步骤。

这里我们可以引入SPE操作过程中一个非常实用的实验技巧——分步收集。

分步收集就是通过收集上样液，淋洗液，洗脱液,并上机分析，从而判断目标化合物具体损失的环节，明确实验步骤中具体需要优化的环节。

根据我们的建议，客户先实施了分步收集，发现亮蓝在上样液中未被检出，淋洗环节有检出。说明亮蓝在小柱上能够很好的被吸附，所以上样液中无亮蓝。但是在淋洗的时候被洗脱下来，所以淋洗部分是亮蓝回收率损失的主要部分。

2  分析目标化合物主要损失的原因

通过前面分步收集，我们发现客户的样品中亮蓝的主要是在淋洗过程中损失的。那么接下来就需要根据实验原理分析亮蓝损失的原因。

合成着色剂专用小柱的填料可与酚类、酸类、蒽醌类等成分形成氢键，因而产生吸附作用。合成着色剂的分子结构中带有磺酸基团，羟基等。故能在酸性溶液中能与人工合成色素形成氢键牢固地结合，从而与天然色素、蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离。然后在碱性条件下能够解吸色素。但填料对天然色素的吸附并不不紧密，天然着色剂在酸性条件下能够被去除。所以在我们的实验过程中，会用甲醇-甲酸-水溶液去淋洗小柱，去除天然色素的干扰。

根据实验原理我们不难发现，淋洗的目的主要是去除天然色素的干扰。而我们的目标化合物亮蓝是一种易溶于水的合成着色剂。不难发现，在这种情况下，淋洗溶液和亮蓝之间也会存在一定的分子间作用力，当淋洗液体积达到一定程度的时候，极易溶于水的亮蓝就容易被淋洗液淋洗下来。

3  提出合理的改进意见

根据前面的步骤我们发现淋洗液和目标化合物亮蓝之间的分子间作用力可能是造成亮蓝损失的主要原因。那么在这种情况下我们需要怎样改进实验过程呢？针对这个案例我们考虑到客户基质是碳酸饮料雪碧，本身基质中成分比较简单。而淋洗的目的主要是去除天然色素，所以在对于雪碧这种基质而言淋洗这一步并不是关键步骤，可以减少用量。建议将10ml的淋洗液体积降至5ml，并且适当降低流速。

4  实验验证

客户根据我们的建议改进实验条件后，发现亮蓝在淋洗时不再被洗脱下来，回收率能达到实验要求。

根据上面的案例分析，我们不难发现，在面对实际检测工作中的方法偏离问题时，我们需要做的是冷静的比较方法的主要偏离点，并明确目标化合物的主要损失步骤，经过仔细思考，大胆推测，认真实验验证找到解决问题的方向。

路漫漫其修远兮，

吾将上下而求索。

实验过程本身就是不断探索创新的过程，

遇到困难和问题不用慌张，

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