为什么跨越内含子就能避免基因组污染

基因组污染产生比目的扩增产物更大的产物，原因是包含了两段外显子中间的内含子，要想判断杂带是否为基因组污染引起，只需 将外显子+内含子是否=杂带分子量 或者 借用无基因组污染的cDNA模板扩增跑电泳（done）2、qPCR扩增时，引物扩增效率默认为2，当引物扩增效率低时（表现为pcr扩增电泳条带亮度低），会影响结果上下调判断，可以通过稀释5个梯度，制作校正曲线来校正。3、RNA提取有基因组污染，会影响qPCR结果吗？如何影响？如何去除基因组污染（done）所谓的跨内含子引物，故名思意就是这一对引物跨过一个内含子，我们知道真核生物基因组上的基因是有内含子和外显子组成的，而外显子被内含子说分隔开，但是内含子是不转录成mRNA的。这就是真核细胞内DNA和mRNA的区别，而我们一般用于检测目标基因转录水平时，使用RT-PCR或者realtime PCR，常常需要针对基因设计一对对的引物，一般来讲，在提取RNA的过程中，会带有基因组DNA的污染，所以，对于原核生物必须经过DNase酶消化去除DNA，而真核生物由于内含子的存在，我们可以设计引物分别在相邻的两个外显子上，这样DNA因为引物中间加了一个很大的内含子，而常常无法P出条带或者预计大小的条带，而RNA反转录后的目的条带是我们预期的，这样就可以免去DNA消化的步骤，通过设计这种跨内含子的引物来排除DNA的干扰，但是，并不是每个基因都能找到合适的引物在相邻的且大小合适的外显子上，所以，经常也会在一个外显子上设计引物，这时候就需要完全消化DNA才能得到可靠的结果4、axygen 品牌的枪头和EP 管有无灭酶？（done 均灭酶）5、如果引物设计跨越了内含子，是否可以忽略?基因组污染？（done）1）每个引物本身在两个不同的引物上引物若跨内含子的话，引物仅能以3'端的一小部分结合基因组DNA，这样的话Tm会很低。在较高的退火温度下，引物几乎无法和基因组DNA结合来引发聚合，而主要是与能够完全配对的cDNA结合并引发反应。2）上下引物，分别位于两个不同的外显子上从cDNA和基因组扩增出来的片段大小不同，从而可以通过用合适的延伸时间来限制基因组中大片段的扩增，消除基因组的DNA污染。