仪器资讯
产品说明书
主要用途
动物细胞钠/钾ATP酶（Na＋/K＋-ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用钠/钾ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在特异性YZ剂存在与否的情况下，受到钠钾ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物细胞裂解悬液Na＋/K＋-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
钠/钾ATP酶（Na＋/K＋-ATPase；EC3.6.1.3），是五类ATP酶（F、V、A、P和E型）中P型ATP酶（PtypeATPase）之一。ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。P型ATP酶，又称为E1-E2ATP酶，通常由一条或两条多肽构成，且呈现两种主要的结构构象E1和E2。这类ATP酶存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括离子和磷脂，例如H+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ag+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+等。P型ATP酶可以分成4种，Ca2+传输性、Na+-K+/H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等。钠/钾ATP酶，又称为钠钾泵（Na+-K+pump），是一种电致（electrogenic）膜蛋白。细胞排钠吸钾时，细胞膜两边无电荷流动，并建立细胞内外离子（胞内低钠、胞外高钾）浓度平衡，维持细胞静态膜电位，控制细胞容量。钠/钾ATP酶是心脏病的重要药物靶标。基于ATP，在钠/钾ATP酶YZ剂乌本苷（ouabain）存在与否的情况下，受到钠钾ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvatekinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reducednicotinamideadeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析钠/钾ATP酶的特异活性。其反应系统为：
Na＋/K＋-ATPase
ATP+H2O→ADP+Pi
ouabain
pyruvatekinase
Phosphoenolpyruvate+ADP→pyruvate+ATP
lactatedehydrogenase
pyruvate+NADH→lactate+NAD+
（高吸收峰）（低吸收峰）
产品内容1
酶活性酶连续反应光谱法定量
清理液（ReagentA）毫升
裂解液（ReagentB）毫升
缓冲液（ReagentC）毫升
酶促液（ReagentD）微升
反应液（ReagentE）毫升
底物液（ReagentF）毫升
阴性液（ReagentG）毫升
专性液（ReagentH）毫升
产品说明书1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（ReagentF），避免光照，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光谱分析的容器
分光光度仪：用于光谱分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（ReagentC）室温预热；底物液（ReagentF）注意避光。然后进行下列操作。
一、样品准备（总蛋白制备）
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞
5．加入xx毫升清理液（ReagentA），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（ReagentB），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．QL涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟2
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如细胞总蛋白或膜蛋白等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（ReagentD）
3．加入xx微升反应液（ReagentE）
4．加入xx微升底物液（ReagentF）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升阴性液（ReagentG）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟
四、样品总活性测定
1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（ReagentD）
3．加入xx微升反应液（ReagentE）
4．加入xx微升底物液（ReagentF）
5．放进37℃培养箱里静置3分钟
6．加入50微升待测样品（注意：50微克膜蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟
五、样品非特异活性测定
1.移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2.加入xx微升酶促液（ReagentD）
3.加入xx微升专性液（ReagentH）
4.加入xx微升底物液（ReagentF）
5.放进37℃培养箱里静置3分钟
6.加入50微升待测样品（注意：50微克膜蛋白；样品须溶解）
7.上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8.即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟
六、计算样品活性3
微升进行蛋白定量检测
1）样品活性（总活性和非特异活性）
[（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X6.22（毫摩尔吸光系数）X10或30（反应时间，分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
或者
[（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品重量；毫克）X6.22（毫摩尔吸光系数）X10或30（反应时间，分钟）]＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
2）样品特异活性
样品总活性测定－样品非特异活性测定＝样品特异活性
注意事项
1．本产品为21次操作（10个样本），包括背景对照测定
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钙盐、镁盐等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
5．建议使用细胞膜蛋白（本公司提供细胞可溶性膜蛋白（粗提）制备试剂盒）
6．加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7．如果测定初期，背景对照吸光读数不稳定，表明体系均衡温度不理想，建议样品加入前孵育由3分钟延长至5分钟
8．反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟
9．测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性
10．光谱测定后，比色皿须清洗彻底
11．建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
12．样品特异活性是指乌本苷敏感的钠/钾ATP酶
13．钠/钾ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列ATP酶类分析技术产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测准确
4
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