Bradford法 该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。 1．Bradford浓染液的配制：将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放413至少6个月保持稳定。该染液也可从Bio-Rad公司购到。 2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线。 3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（Z好用PBS）。 4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。 5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min． 6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。 注：Bradford法对BSA的测定值均为其重量的2倍。 Bradford斑点法 该方法特别适用于检测层析柱洗脱组分以定位蛋白洗脱液。例如用于检测亲和层析洗脱液。 1．先配制Bradford浓缩染液。将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，放4℃至少可保存6个月。该染液也可从Bio-Rad公司购到。 2．将8u!待测蛋白质样本转移至一条Parafilm、SaranWrap上或微孔板孔中。同时应设一样本缓冲洗脱液作为空白对照。 3．每个样本孔中加2glBradford浓染液并混匀。 4．大约2min后，含有蛋白质的样本将变为蓝色。该方法的灵敏度约为10ug／ml此反应在去污剂浓度超过0．2％时非常敏感。但KCl、NaCl、MgCl2或EDTA对其无影响，Tris仅有轻微的影响。
2004-07-19
