猪糖化血红蛋白（HbA1c）ELISA试剂盒操作说明书

猪糖化血红蛋白(HbA1c)ELISA试剂盒操作说明书

本试剂盒仅供研究使用。

实验原理

猪糖化血红蛋白(HbA1c)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪糖化血红蛋白（HbA1c）水平。用纯化的猪糖化血红蛋白（HbA1c）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入糖化血红蛋白（HbA1c），再与HRP标记的糖化血红蛋白（HbA1c）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的糖化血红蛋白（HbA1c）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪糖化血红蛋白（HbA1c）浓度。

猪糖化血红蛋白(HbA1c)ELISA试剂盒组成

1、30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶

2、酶标试剂6ml×1瓶8标准品（6400nmol/L）0.5ml×1瓶

3、酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶

4、样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份

5、显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张

6、显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

猪糖化血红蛋白(HbA1c)ELISA试剂盒操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

3200nmol/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

1600nmol/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

800nmol/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

400nmol/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

200nmol/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品Z终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

猪糖化血红蛋白(HbA1c)ELISA试剂盒注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间Z好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，Z好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔diyi孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请Z后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期：6个月