蛋白质纯化方法-聚焦层析

聚焦层析亦是一种柱层析，所以，和其他的层析相同，其亦是将缓冲交换剂作为固定相，将缓冲剂作为流动相。能够从聚焦效应、蛋白质的行为以及pH梯度溶液的形成这三方面来对聚焦层析原理进行阐述。

1、蛋白质的行为

层析柱中的pH值以及蛋白质的等电点（PI）决定了蛋白质所带电荷。当蛋白质的PI超过柱中的pH时，蛋白质带正电荷，并且不会结合阴离子交换剂。随着洗脱剂向前移动，随着淋洗时间延长，固定相中的pH值会发生变化。当白质移动至环境pH高于其PI时，蛋白质由带正电变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。因为通过了洗脱剂，蛋白质周围的环境pH 发生变化，低于PI，其又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，将反复进行着上述过程，所以在各自的等电点洗脱下各种蛋白质，从而使得分离的目的达到。蛋白质不一样，具有的等电点等电点，离子交换剂与它们结合之前，有着不同的移动的距离，根据等电点排列洗脱出来的先后次序。

2、聚焦效应

聚焦效应是指pH梯度环境中，根据蛋白质的等电点对其进行排列的过程。聚焦效应是以pH梯度的形成为先决条件的。如果在已形成pH梯度的层析柱上加入一种蛋白质，因为洗脱液的连续流动，其将向着与它等电点相同的pH处迅速地迁移。从这个位置开始，蛋白质一直会通过缓慢的速度吸附、解吸附，一直到在等电点pH时被洗出。如果在析出此蛋白质样品之前，再将第二份同种蛋白质样品加入，那么在洗脱液的作用下，第二份同种蛋白质样品不被固定相吸附，会用相同的速度向前移动，一直到迁移至近似本身等电点的环境处位置，之后两份样品以同样的速度迁移。左后被同时从柱底洗出。实质上，同时从柱底洗出。分次加入一种样品时，只要还没有洗出先加入者，并且有一定的时间进行聚焦，那么还能够在柱上加入剩余样品，就能够顺利完成其聚焦过程，得到满意的结果。

3、PH梯度溶液的形成

在离子交换层析中，依靠梯度混合仪来使得pH梯度溶液的形成实现。当使用阴离子交换剂进行层析时，将高pH溶液装入梯度仪的混合室，而将低pH极限溶液装入另外一个室，之后将层析柱的下端出口打开，使得洗脱液从柱体连续不断地流过。此时从柱的上部到下部溶液的pH值的变化就是由高到低的。当洗脱液流进多缓冲交换剂时，因为具有缓冲能力的电荷基团为交换剂所携带，因此，能够自动形成pH梯度。

例如，当将作为固定相的阴离子交换剂PBE94装入柱中时，首先使用起始缓冲液将pH值平衡到9，然后再将从柱体通过含有pH值为6的用作流动相的多缓冲物质的淋洗液，此刻，在碱性阴离子交换对和多缓冲剂中酸性Z强的组分相结合发生中和。柱内每点的pH值随着不断加入淋洗液而逐渐下降。按照此方法处理一段时间后，pH6～9的梯度就从层析柱顶部到底部形成了。

聚焦层析柱中在淋洗过程中自动形成了pH梯度溶液，然而随着淋洗的进行，pH梯度会不断向下迁移，从底部流出液的pH由9至6Z后保持恒定，此时就不存在层析柱的pH梯度。