蛋白质纯化的主要方法及注意事项

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

主要方法

1.蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到）。

2.按照配体特性的分离-亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质）

3.低温有机溶剂沉淀法，使用如甲醇，乙醇或丙酮等与水可混溶的有机溶剂，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率更加的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4.按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心（在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度，质量和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤（一种柱层析）；超过滤（利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质）。

5.按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析（使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小）；（因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为0，使分子间静电斥力减少了，所以，聚集沉淀比较容易，这时具有Z小的溶解度）。

6.按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

注意事项

1.为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2.缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

3.为了避免蛋白质的氧化，将0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇）加入到缓冲溶液中。

4.为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将1~10mmol/LEDTA金属螯合剂加入。

5.为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6.尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作

7.蛋白浓度不要太稀。

8.除非是进行聚焦层。否则pH需要合适，防止所使用的缓冲溶液pH与pI相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9.使用蛋白酶YZ剂，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将DNA酶加入来使得DNA降解，避免DNA对蛋白的污染。