细胞培养方法

细胞培养箱是提供稳定的温度（37°C）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（95%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。下面就让小编为你介绍一下细胞实验的方法。

一、细胞复苏实验

细胞实验在无菌的环境下进行操作至关重要，实验操作时需要戴上手套并用酒精对手套进行消毒处理。

1.为了确保实验在无菌的环境中进行，实验操作台需要用照射消毒半个小时，实验所需的无菌吸管，无菌枪头，1000μl的移液枪，一次性吸管，中型培养皿以及酒精灯、废液缸等也需要消毒。

2、加入2—3ml细胞培养基，即10％FBS（胎牛血清）和DMEM高糖备用。

3.从零下80度的冰箱里取出需要复苏的细胞，放入37℃的水浴中摇晃让其迅速溶解，细胞溶解后，将其置于1000r/m的离心机中离心5分钟，然后取出。

4.将离心后的细胞

弃上清，用移液枪取1ml培养基轻轻吹打均匀，取出细胞匀浆加入到之前加好培养基的培养皿中，振荡均匀，以使细胞在培养皿中生长均匀，吧培养皿在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

5、等到细胞完全贴壁生长时取出换液。

二、细胞换液

所有实验均需在无菌环境下操作。

1.将酒精灯、一次性吸管、废液缸、镊子等这些实验所用到的耗材放入无菌操作台用紫外线进行消毒杀菌。

2.将培养的细胞从培养箱中取出，用倒置显微镜进行观察。

3.用酒精对培养皿进行消毒，然后将培养皿放入无菌操作台，弃原有的培养基，使用PBS冲洗两遍。

4.往培养皿中加入新的培养基，用倒置显微镜进行观察。

5.往培养箱内重新放入换好液的培养皿进行培养

三、细胞传代

在培养皿或培养瓶中，当细胞占内壁表面80％的比例时，就需要进行

传代。

1.将实验所用到的耗材放入无菌操作台用紫外线进行半小时的消毒杀菌。

2.将需要传代的细胞从培养箱中取出，然后放入无菌操作台，弃原有的培养基，使用PBS冲洗两遍。

3.加入1ml左右的胰酶对细胞消化4分钟，然后用倒置显微镜进行观察。

4.观察到细胞从贴壁状态变为悬浮状态，且变圆变小

5.加入2倍胰酶的培养基终止消化，用一次性吸管吹打使细胞全部悬浮。

6.往1500r/m离心管中放入该细胞悬液，离心5分钟。

7.从其中一个离心管中取出细胞，弃上清，入1ml的培养基吹打均匀，然后加入到全新的已经加好培养基的培养皿中，振荡均匀，放入培养箱中进行培养。

8.对其他离心管中细胞进行冻存，往其他离心管加入900μl的冻存液（20％FBS），然后避光加入100μl的DMSO（二甲基亚砜）。

9、做好标记并用封口膜封好，放入4℃冰箱冻存40分钟

10、把4℃冻存的细胞取出放入-20℃冰箱冻存20分钟，Z后后放入-80℃冰箱长期保存