EAD Talk | 声音专栏：细节控，看EAD生物药深度表征

2024-08-2998

Hey，大家好，我是您的质谱应用专家刘婷，20年的一线应用经验，让我深感到质谱应用信息共享的重要性。无论是质谱前沿技术，还是常用技术的深入应用，都希望在我的这个专栏中能和大家分享。“婷视角，看分析“希望拓宽您的视野，进入美妙的的质谱应用世界。

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大家好，我们又见面了。往期的节目内容介绍了EAD的研发背景、与CID碰撞技术的互补性，以及EAD在脂质结构表征、异构体定量上的应用。本期内容我们开启新征程——细节控，看EAD生物药深度表征。当KE<=10eV时，EAD主要表现为ECD和HotECD模式，应用于多电荷蛋白鉴定和生物药深度表征。

本期内容

生物药研发如火如荼，生物药表征是生物药质量控制的重要一环。液质联用（LC-MS/MS）是进行生物药表征的主要仪器，质谱技术传统的CID碎裂模式主要碎裂多肽的酰胺键（O=C-N），形成b、y离子；这种弱键断裂无法有效确认氨基酸异构体，也不能深度表征二硫键，以及生物药修饰位点。EAD碎裂模式正好可以弥补CID的不足，EAD断裂的是多肽的N-C_a形成c、z离子，或是断裂S-S键²，更能解决上述难题，有利于生物药的深度表征。下面我就从氨基酸异构体区分，二硫键位点，翻译后修饰，这三方面介绍EAD生物药深度表征。

图1. 不同碎裂模式对多肽股价碎裂位点¹

我们先来看EAD区分氨基酸异构体，如亮氨酸（Leu）与异亮氨酸（Ile），天冬氨酸（Asp）与异天冬氨酸（Iso-Asp）。图2展示了EAD对异天冬氨酸，亮氨酸与异亮氨酸碎裂的不同碎片，这使氨基酸异构体的区分变得轻松。图3展示了来自同一单抗酶解后的两种肽段，序列中分别包含异天冬氨酸和天冬氨酸，它们能被色谱分离，但仍然需要用各自的碎片离子分辨肽段序列。使用EAD技术，多肽能基于确证离子z3-57和c13+57进行异天冬氨酸的精准识别。

图2. (A) EAD技术下异天冬氨酸形成的c+57和z-57的碎片离子；（B）亮氨酸的z离子发生一个43Da的侧链丢失，异亮氨酸发生29Da的侧链丢失，留下w离子。²

图3. EAD MS/MS谱图，EAD碎裂能获得更多肽段的二级离子信息，可协助确定D/isoD

我们再来看EAD确认二硫键位点。通过对双特异性抗体未还原酶切后的肽段进行二硫键分析，分别使用CID和EAD模式进行数据采集。下图4中可以看到，在分子量较大（分子量7612Da），带电荷数较多（8个电荷）的二硫键相关序列分析中，CID模式仅能对序列末端的氨基酸进行碎裂，在二硫键半胱氨酸附近的很长一段序列，无法有效碎裂出相关的碎片离子，而EAD模式中，在半胱氨酸周围的序列可以被碎裂，获得更多的MSMS信息，从而对二硫键进行更深入的表征。

图4. EAD 获得更丰富的碎片，使S-S断裂的肽段得到更可信的归属

最后，我们来看看EAD解决翻译后修饰难题。糖基化修饰是评价抗体的关键质量属性之一，对IgG（单抗）酶切后肽段样品分别进行CID和EAD碎裂，如下图所示，在CID碎裂模式中，出现大量的糖碎片峰，并非完整糖型，同时肽段的碎片离子无法完全覆盖整个序列，这样就不能直接给出糖基化位点，为确认工作带来挑战。而在EAD模式中，糖肽二级碎片上可以保留完整的糖型，可以明确获得糖基化修饰的位点和糖型信息，并且肽段覆盖度可达100%（图5）。