精准剖析:EAD/CID混合碎裂技术引领磷酸肽研究进入新维度
前言
酪蛋白是牛奶的重要组成部分和重要的营养来源,主要包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白4种酪蛋白。酪蛋白具有复杂的磷酸化等翻译后修饰,如αs1-酪蛋白有9-10个磷酸化位点,αs2-酪蛋白有10-13个磷酸化位点,β-酪蛋白有5个磷酸化位点。酪蛋白的磷酸化修饰在酪蛋白胶束的形成以及与钙和锌等二价阳离子的相互作用和转输中起着重要的作用,这些功能可以促进营养物质在哺乳婴儿肠道中的吸收。所以,对于牛奶中酪蛋白的磷酸化修饰的比例和位点的表征,可以准确和快速评价牛奶制品的产品质量属性和批次一致性。
蛋白翻译后修饰(PTMs)对于蛋白质的结构和生物学功能的具有决定性的作用。因为可通过对肽段的二级碎片离子谱图的分析进行翻译后修饰表征,质谱技术是目前被广泛使用的用于PTMs表征的方法。ZenoTOF? 7600系统上具备使用电子活化解离(EAD)和碰撞诱导解离(CID)两种不同的碎裂模式产生用于磷酸肽进行表征的二级质谱信息 (图1)。与单独使用EAD或CID相比,使用混合EAD/CID碎裂技术可以提高酪蛋白肽段的序列覆盖率,且经EAD/CID碎裂所产生的丰富的碎片离子能够帮助准确识别酪蛋白的磷酸化修饰位点。
图1. ZenoTOF 7600系统上混合EAD/CID碎裂技术的示意图
使用ZenoTOF 7600系统
进行磷酸肽表征的主要特点
1. ZenoTOF 7600系统的Zeno trap(Zeno 阱)通过提高二级离子的占空比,显著增强二级离子响应强度,确保低丰度的磷酸肽产生高质量的MS/MS图谱;
2. EAD碎裂产生的c和z碎片离子,能够准确确定磷酸化修饰位点;
3. EAD碎裂技术结合CID碎裂技术,即使是具有多个翻译后修饰的长肽段也可以实现几乎完整的序列覆盖;
4. 翻译后修饰的数据处理可以使用 OS软件进行,并与其他处理软件(如Skyline软件、MSFragger和Peaks Studio等软件)兼容。
实验方法
样品制备:
酪蛋白在低pH条件下从牛奶中利用沉淀法纯化,用胰蛋白酶酶解除盐以后得到肽段溶液。
液相色谱和质谱:
Waters M-Class液相色谱,色谱柱:ProteCol PEEKSIL C18G(3μm, 200 ?, 250 × 0.3 mm),25min分离梯度。ZenoTOF 7600系统搭配OptiFlow Turbo V离子源。源参数设置:离子喷雾电压5000 V,源气温度150℃,气帘气35 psi,gas1 20 psi,gas2 15 psi。
实验结果
1. 使用EAD/CID混合碎裂可以生成碎片信息丰富的二级谱图
ZenoTOF 7600系统既可以单独进行EAD碎裂,也可以进行EAD和CID混合碎裂。EAD/CID混合碎裂能够产生碎片信息更丰富的MS/MS图谱,图2显示了β-酪蛋白中肽段FQSEEQQQTEDELQDK经过EAD/CID混合碎裂的二级谱图。与EAD单独碎裂相比,EAD/CID混合碎裂不仅能够产生丰富的碎片离子确保肽段的MS/MS序列覆盖,还能够在低质量区域(红色标识区域)产生更多样化的碎片离子。
图2. EAD/CID混合碎裂对β-酪蛋白肽段FQSEEQQQTEDELQDK二级谱图的影响
2. 使用EAD/CID混合碎裂能够增加长肽段的序列覆盖率
EAD/CID混合碎裂能够增加长肽段的序列覆盖率,例如,αs1-酪蛋白中肽段
QFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEK含有42个氨基酸,包括4个脯氨酸残基。使用EAD/CID混合碎裂可以显著提升该肽段的序列覆盖率(图3)。b、c、y、z+1和z+2碎片离子基本能够完整覆盖该序列。
图3. αs1-酪蛋白中肽段QFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEK的EAD/CID混合碎裂的MS/MS谱图,以及CID碎裂与EAD/CID混合碎裂的序列覆盖率比较
3. 使用EAD/CID混合碎裂能够区分磷酸化位点和覆盖多磷酸化肽段
EAD/CID混合碎裂能够实现准确区分含有不同磷酸化位点的磷酸化肽段的同分异构体,如图4所示,色谱分离显示αs2-酪蛋白肽段NTMEHVSSSEESIISQETYK具有3个同分异构体。使用 OS软件对质谱采集数据进行分析,在b、c、y、z、z+1和z+2碎片离子之间观察到极好的碎片离子信息互补性,其中c、z+1和z+2碎片离子能够帮助准确确认翻译后修饰位点信息(如绿色标识区域)。
EAD/CID混合碎裂没有观察到携带不稳定修饰的片段离子的丢失,在αs1-酪蛋白的肽段QMEAESISSSEEIVPNSVEQK中也观察到同样的结果(图5)。该段肽段由21个氨基酸(包括一个脯氨酸残基)和5个磷酸化位点组成。尽管肽段结构复杂,但是通过EAD/CID混合碎裂仍然实现了100%的序列覆盖,并且翻译后修饰位点通过c和z+1碎片离子得到解析。
图4. αs2 -酪蛋白多磷酸化肽段
NTMEHVSSSEESIISQETYK的XIC图和MS/MS序列覆盖
图5. Αs-1酪蛋白多磷酸化肽QMEAES[Pho]IS[Pho]S[Pho]S[Pho]EEIVPNS[Pho]VEQK的MS/MS谱和序列覆盖
总结
ZenoTOF 7600系统上的EAD碎裂或EAD/CID混合碎裂可用于复杂的肽段序列及翻译后修饰分析;
EAD/CID混合碎裂可以产生碎片信息丰富的MS/MS谱图,b、c、y、z、z+1和z+2碎片离子确保了序列覆盖的完整性,同时保留翻译后修饰位点信息;
在ZenoTOF 7600系统上, EAD/CID混合碎裂方法可以轻松地转化为靶向多反应监测(MRM??)方法,实现对酪蛋白中不同的磷酸肽异构体的定量和快速监测;
本实验开发了一种检测和表征酪蛋白中复杂磷酸肽的方法,这为未来开发基于质谱的此类蛋白定量方法提供参考。
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扩展阅读
1. Potriquet, J., Pribil, P., Winter, D. (2023). Improving complex phosphopeptide characterization with hybrid EAD/CID MS/MS fragmentation, TN: MKT-29611-A.
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