Organoids 类器官（器官芯片综述）

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类器官是简单的基于组织工程细胞的体外模型，它概括了体内组织的复杂结构和功能的许多方面。它们可以被解剖和询问，用于人体组织发育、再生和修复的基本机制研究，也可以用于诊断、疾病建模、药物发现和个性化医疗。类器官来源于多能干细胞或组织驻留干细胞(胚胎或成体)，或来源于健康或病变组织(如肿瘤)的祖细胞或分化细胞。迄今为止，已经报道了许多支持类器官培养和生长、增殖、分化和成熟的类器官工程策略。本文强调了这些材料和方法的选择和发展的基本原理，以控制细胞/组织生态位;因此，工程类器官的结构和功能。我们还讨论了生成健壮类器官的关键考虑因素，例如与细胞分离和播种，基质和可溶性因子选择，物理线索和整合相关的因素。还概述了类器官群落中数据质量、可重复性和沉积的一般标准。最后，我们阐述了类器官在不同应用中的局限性，以及未来几年类器官工程的重点。

干细胞通过细胞更新、迁移、分化和凋亡，在维持器官大小、结构和功能方面起着至关重要的作用。干细胞存在于一个确定的微环境中，通常被称为干细胞生态位，以调节干细胞的命运。考虑到这些环境线索的重要性，已经有许多组织工程尝试在体外模拟干细胞生态位，以实现对细胞-细胞和细胞-基质相互作用的高时空控制，并使用工程水凝胶和微设备复制机械化学线索。1977年，从小鼠肉瘤肿瘤中提取了一种基底膜细胞外基质(ECM)，它含有独特的ECM成分和生长因子的混合物，并用于体外细胞培养。Matrigel后来被证明可以使乳腺上皮细胞在三维空间中生长，并通过乳蛋白分泌物形成管腔，而嵌入在Matrigel中的成体肠道干细胞在组织特异性生长因子混合物的存在下也被证明可以自组织成三维隐窝绒毛结构。一个多世纪以来，类器官研究与3D细胞培养、干细胞和组织工程交织在一起，在定义、标准和范围上存在各种争论。

类器官是一种自组织的3D组织，通常来源于干细胞(多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞)，并模仿器官的关键功能、结构和生物复杂性。包含类器官的细胞可以来源于诱导多能干细胞(iPSCs)或组织源性细胞(TDCs)，包括正常的干细胞/祖细胞、分化细胞和癌细胞。与传统的二维培养和动物模型相比，类器官培养在体外重现体内组织样结构和功能的同时，在模型中具有患者特异性。类器官培养比动物模型更易于操作和深入的生物学研究。因此，类器官培养已被广泛应用于药物发现、个性化伴随诊断和细胞治疗等领域。

类器官培养在细胞组成方面表现出显著的异质性和可变的复杂性，在自组装过程中形态发生可能受到较差的控制，并且通常缺乏基质、血管和免疫成分。因此，利用我们对器官发生的理解，以及细胞如何以干细胞生态位的形式与其细胞和物理微环境相互作用，来改善类器官培养是非常必要的。基于这些见解，可以开发生物工程策略来精确控制类器官发育过程中的干细胞决策。例如，从早期胚胎发生研究中，我们知道形态发生梯度调节组织模式和发育。微流体系统可以通过扩散形态形成因子来产生所需的浓度梯度，从而产生具有空间模式的所需细胞类型。除了生化信号外，干细胞还会经历来自外部微环境的主动和被动力量，并将这些物理刺激转化为生化反应。这些物理线索来自基质、外力和/或细胞-细胞相互作用。与依赖天然或生物衍生的ECM(如刚度可调性有限的Matrigel)不同，可以利用合成水凝胶或其他ECM组合来控制基质的物理特性。液体与细胞膜的摩擦也能对细胞施加剪切应力。动态生物流体环境对不同类型的细胞有不同程度、方向和频率的影响。因此，微流体系统和生物反应器可以在微观和宏观尺度上提供灌注。最后，现在我们知道细胞与它们的邻居相互作用，并以集体的方式对外界刺激作出反应。地形线索，如邻近细胞的曲率和形状，可以影响干细胞的决定。最近的一个神经管模型剖析了折叠过程，并证明了微图案的几何约束可以控制神经管样结构的最终形态。

基于工程细胞的体外模型(如类器官)是否需要忠实地再现体内起源器官的结构和功能是有争议的。一个趋势是在体外尽可能多地概括体内组织结构和功能，以证明日益复杂的模型的生理相关性。对于生物工程师来说，人工创建的体外模型只需要概括体内组织的特定特征，与感兴趣的生理或疾病功能相关。人们对建立高度复杂的模型并期望它们能准确地模仿体内器官的起源持乐观态度。对于大多数用户来说，更简单的模型——例如单层或3D培养的一个或两个细胞的模型——比更复杂的模型(如组装体或其他多细胞模型)更适用于机制研究和应用。

在本文中，我们重点介绍了建立类器官培养的基本原理，并为不同应用选择合适的材料和方法提供了指导原则。我们首先讨论了建立类器官培养的实验考虑因素，将其分为四个主要组成部分——细胞、可溶性因子、基质和物理线索——并讨论了整合这些成分的方法(图1)。我们还讨论了生成更复杂但更健壮的类器官的关键考虑因素，例如与细胞分离和种子、基质和可溶性因子选择、物理线索和整合相关的因素。还概述了类器官群落中数据质量、可重复性和沉积的一般标准。最后，我们阐述了类器官在不同应用中的局限性，以及未来几年类器官工程的重点。

                                图1: 类器官工程的组成

建立基于类器官的培养需要考虑构成类器官培养的主要成分——细胞、可溶性因子和基质、物理线索——以及这些成分的成功整合。ASCs，成体干细胞;csc，癌症干细胞;ECM，细胞外基质;FGF，成纤维细胞生长因子;诱导多能干细胞; OoC organ-on-a-chip; TDCs，组织来源的细胞。

实验
细胞来源

在规定的物理化学条件下，从iPSCs、成人或胎儿细胞、干细胞/祖细胞或分化细胞中获得了小肠、结肠、胃、食道、舌头、肝脏、肺、胰腺、心脏、耳朵和皮肤等组织。任何给定的类器官的起始细胞群都是至关重要的，它不仅影响所获得的结构的可变性和异质性，而且还影响他们旨在模拟的组织的功能。为了建立组织源性类器官或癌性类器官，分别通过优化的组织分离方法获得组织驻留干细胞/祖细胞/分化细胞或肿瘤细胞。对于iPSC衍生的类器官，iPSC系被建立，并完全具有起始细胞的特征。通过优化的组织分离方法获得患者/组织来源的干细胞，然后嵌入到模拟干细胞壁龛的3D基质中。iPSCs可以在饲养细胞上维持和扩增为未分化的克隆群体。为了举例说明组织源性类器官的产生，我们以肠道类器官为例(图2a)，因为这是第一个建立的组织源性类器官类型7。纵向打开小肠和结肠，清洗，然后切成2-4毫米的碎片，以增加酶消化或进一步机械解离的表面积。EDTA治疗用于螯合钙，破坏细胞-细胞粘附和组织完整性。从收集的隐窝中取出较大的组织碎片和整个细胞，收获的原代肠隐窝用于播种和产生肠道类器官培养物。

                                      图2: 流程流程图

类器官可以由组织源性细胞(tdc)或诱导多能干细胞(iPSCs)产生。为了从tdc中生成类器官，从人类或动物(如肠道和胃)获得组织样本。将肠道组织样本打开、清洗，然后切成小块(2-4毫米)，以增加酶解或进一步机械解离的表面积，以分离单个肠道干细胞或隐窝。经过几轮清洗和纯化后，收获的干细胞或隐窝将用于播种和产生类器官培养物以进行扩展。b .为了利用基因工程技术从iPSCs中生成类器官，iPSCs被维持和扩增为未分化的克隆群体，并在饲养细胞或定义的细胞外基质(ECM)基质上聚集成胚状体。通常，多能干细胞以细胞聚集体的形式收获，这可以保持细胞间的接触，并产生具有更高活力的细胞群。这些聚集体通过胚层规范进一步诱导形成内胚层球体、中胚层圆顶和神经外胚层基质，用于其他应用。

类器官培养的起始细胞群通常从成人或胎儿组织活检样本中获得。最常用的组织解离方法是酶解，它可以溶解ECM45。酶鸡尾酒的组成和酶解过程的功效因组织类型而异，在某些情况下，可以添加DNA酶来去除坏死细胞释放的过量DNA。根据组织类型的不同，组织片段可以进一步与胶原酶、弹性酶或蛋白酶等酶孵育，产生单细胞悬液，然后在Matrigel中播种。酶解方法可能影响回收细胞的细胞状态，因为它可能需要在酶混合物中延长时间来解离大多数组织驻留干细胞。组织分离也可以机械地实现;尽管机械分离更快、更便宜，但细胞产量和活力可能不一致。机械和酶解可以结合起来产生更好的细胞产量。在组织分离后，利用已知的生物标志物或物理特征鉴定和收集用于类器官发育的TDC。组织特异性干细胞标记通常用于鉴定和分离所需的干细胞以生成类器官。荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选基于多个参数分离细胞，包括大小、形状和细胞表面标记物表达。其他分离技术包括激光捕获显微解剖和人工细胞提取。

iPSCs可以作为未分化的克隆群体维持和扩增许多代。未分化的人多能干细胞通常维持在饲养细胞或确定的ECM基质上。由于单个iPSCs在体外不能很好地存活，iPSCs通常以细胞聚集体的形式收获，这保持了细胞间的接触，产生了具有更高活力的细胞群。物理刮削也可以弥补细胞聚集体不均匀性的不足。解离酶混合物的选择应基于细胞敏感性水平和培养细胞是否分泌过多的ECM，使细胞难以从细胞培养板上分离(图2b)。

来自活检样本或手术切除的肿瘤组织通常也与正常组织类似，以分离肿瘤细胞以生长为类器官。从外周血、腹水和胸腔积液等液体样本中分离出的肿瘤细胞可用作生成类器官的起始材料。患者来源的肿瘤类器官可以从微创巴氏涂刷材料获得的样本中产生。由于肿瘤细胞数量少，活体组织活检样本或液体样本中的肿瘤细胞可以首先在动物模型中扩增作为异种移植物，以便获得足够的细胞用于类器官的生成。在肿瘤组织的情况下，最好限制组织解离，以便分离细胞簇而不是单个细胞。影响肿瘤衍生类器官产生的一个关键因素是，从组织中分离出来的细胞通常既含有癌细胞，也含有正常细胞。虽然对某些肿瘤来说，有可能通过排序来富集成瘤细胞，但对于大多数肿瘤来说，目前还没有可靠的方法在将正常细胞群和肿瘤细胞群播种到基质中进行培养之前进行分离。克服这一问题的一种方法是利用培养条件，通过使用选择性培养基来忽略正常类器官生长所需的某些因素，因为肿瘤细胞在恶性转化过程中逐渐失去对这些因素的依赖。血液污染，特别是红细胞污染，也会影响类器官的产生和基质的稳定性，因此通常使用通过溶解来消除这些污染的标准方法。

基质胶

在细胞分离之后，通常将细胞植入生物衍生基质(如Matrigel)或天然ECM(如胶原)中，或植入合成水凝胶中。基质层主要由层粘连蛋白、IV型胶原、肠动蛋白、纤维蛋白和生长因子组成，其组成与基底膜相似。作为上面使用肠道类器官的例子的延续，我们现在简要地描述细胞是如何被封装成基质的。分离的肠隐窝首先被重新悬浮在冷基质中，然后移液到预热的低附着孔板中进行培养，产生细胞基质结构的扁平半球形凝胶。肠道类器官培养基的完整组成此前已有报道。类器官通过传代，通过从基质中分离类器官，去除单个细胞和计数隐窝来测量增殖率。膨胀率的计算方法是每孔中类器官的数量除以该孔中Matrigel中初始隐窝的数量。

尽管Matrigel可以支持类器官培养，但这种生物衍生基质的固有异质性和不明确的组成对改善类器官培养所必需的生化和生物物理时空线索几乎没有控制。因此，其他具有明确成分的基质已被探索作为matrix的替代基质，如重组人胶原、纤维蛋白或合成水凝胶。天然基质可以重组地从蛋白质或多糖生产，以解决批次间的差异性Matrigel。另一方面，合成水凝胶已经成为一种强大的工具，可以独立操纵生物化学和生物物理基质特性，以控制类器官特征并增强功能。总的来说，理想的类器官基质应该是应力松弛的，在生化和生物物理特性上是高度动态的，以适应或控制培养过程中类器官结构的变化。例如，基于聚乙二醇(PEG)的动态水凝胶最近被证明能够实现可复制的肠道类器官形成，并展示了如何调节水凝胶特性来控制培养的类器官的干性和分化。水凝胶的粘弹性也被证明可以定义生长的类器官的机械约束。在其他的例子中，成体干细胞的活性可以用具有光可降解部分的聚乙二醇水凝胶来控制，仿生聚合物可以被修改以结合基本的ECM信号来产生具有定制特征的类器官。可调节的聚乙二醇水凝胶可促进肠隐窝发芽，而基于葡聚糖的gmp相容水凝胶可支持细胞延长传代。最后，微制造阵列最近被报道能够均匀地产生隐窝绒毛状上皮。即使使用合成基质生长类器官取得了最近的进展，合成基质生长类器官的效率仍然低于基质培养的类器官。开发更好的矩阵的需求尚未得到满足。

类器官可以从单细胞产生的圆形菌落或最初的多细胞结构(如肠隐窝、细胞聚集体或微花纹细胞中产生。后一种方法的目的是建立一个细胞生态位，从一开始就包括其他相同或不同类型的细胞。要形成细胞聚集体，最简单的方法是使用涂有亲水性水凝胶的超低附着皿，以防止细胞附着;随后的离心可以促进聚集体的形成，增强细胞间的接触。细胞聚集体的大小和压实可以调整和控制，例如通过使用微孔阵列。另一种成熟的形成细胞聚集体的方法是悬挂滴法，在滴的底部形成聚集体。在最近的一个例子中，液滴微流体被用于聚集小鼠胆管细胞，形成与肝间充质细胞复杂的类器官。液滴微流体可以每孔打印一个类器官，并且能够快速生成类器官内的异质性。基于微流体的微流体技术也被用于在不同发育阶段对肠道类器官细胞进行更好的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，揭示了广泛的群体异质性。微孔结构或微制造柱阵列也被开发出来，以增强细胞聚集的均匀性。在一个例子中，微制造的Laminin-512模式被证明可重复地支持人类多能干细胞在Matrigel中形成管腔结构并分化为人类神经管样结构。这些例子，以及其他在该领域出现的例子，说明了我们如何推断生物材料和组织工程的知识，以提供对类器官结构和功能的精确控制。

溶性因素

类器官培养基本上是基于我们积累的发育生物学知识，其中可溶性线索以一种时空可控的方式呈现给细胞。用于将tdc和iPSCs分化为各种组织类型的可溶性因子列于补充表1。在类器官培养中，这些可溶性线索在体外以生物制剂的形式重现，主要是蛋白质，如生长因子，或小分子药物，它们可以激活或抑制信号通路。尽管生长因子可能昂贵且不稳定，而且许多小分子药物可能影响多种途径，导致再现性差，但一些类器官方案结合了生物制剂和小分子药物的使用。使用来自产生生物活性生长因子(如L-Wnt-3A)的工程细胞系的条件培养基，可以替代常用的生长因子，如WNT3A配体。这些条件培养基面临类似的批次差异问题，需要严格的测试以确保可重复性。因此，新的替代分子开始作为条件培养基的潜在替代品出现。

考虑如何以及何时将可溶性线索添加到类器官培养中是至关重要的，因为体内的可溶性线索通常由ECM或附近的细胞呈现给细胞，在时间和空间上是协调的。这就是时空呈现的概念。例如，现在已知成纤维细胞生长因子(FGF)的活性和特异性可由细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖调节，这表明向细胞培养基中添加游离FGF可能无法重现体内组织中FGF的可用性。以时空相关的方式呈现可溶性线索的重要性对于将人类多能干细胞培养成具有多细胞系的复杂结构(如肾类器官)尤为重要。根据先前的研究83，已知输尿管上皮由早期迁移的体前中胚层细胞发育而来。为了概括这一过程，研究了在加入FGF之前初始Wnt信号传导的不同持续时间的影响。可溶因子的时空表现可以通过不同的组织工程方法来实现。在一种策略中，这些生长因子可以被封装在纳米颗粒中，并结合到细胞表面以控制释放。为了模拟某些生长因子是如何在体内与ECM结合的，研究人员将聚合物与肝素结合，肝素可以与生长因子结合，或者将这些生长因子与聚合物本身结合。表面捆绑也可以通过纳米技术来实现，例如纳米压印光刻、电子束和静电纺丝，以及带有纳米柱、纳米粒子或纳米通道的衬底，模拟三维类器官培养的基膜。最后，微流体系统可以用来创建精确控制机械化学性能的微型壁龛。通过定向流动和气体或小分子的梯度，这些系统可以很好地控制类器官内的环境参数。在一个例子中，开发了一种微流体神经管装置，以同时呈现生长因子的相反梯度来指导神经管图案，从而能够再现体内结构。

物理信号

除了生化提示外，考虑何时以及是否有必要为培养的类器官提供适当的物理提示也很重要。营养物的供应和废物的清除依赖于扩散，在类器官生长到更大的组织结构时变得不那么有效。这就是为什么肠道类器官需要分裂成更小的细胞簇并定期重新播种的原因。在脑类器官培养中，营养物质和废物扩散不足也是一个问题，由于无法获得营养物质，所产生的毫米级结构通常在内核内表现出坏死。这个问题可以部分地通过摇晃培养、旋转生物反应器或连续搅拌下的悬浮液或连续搅拌生物反应器来解决。这些生物反应器可以监测pH值，温度，氧气和葡萄糖水平，以最大限度地提高传质，同时最大限度地减少剪切应力。在这方面，可灌注微流控芯片也被开发出来，以促进类器官的长期培养。最后，考虑提供地形线索来控制体外类器官培养可能是有用的;已知底物的地形可以调节细胞面积、形状和细胞间相互作用，从而产生影响干细胞命运的生化信号。在软性水凝胶上生长的肠道类器官已经证实了地形导向的形态发生。

整合线索

与原始的自组织类器官模型相反，上述线索可以被整合以赋予对类器官形态发生的更大控制。在组织工程领域，线索整合是一种常用的体外和体内组织构建策略。理想情况下，特定的物理或化学线索应该以时空、生理相关的方式，使用简单、可重复和可靠的方法呈现(补充表2)。我们以肠道类器官为例说明了这一点。在鉴定和分离出居住在隐窝中的LGR+肠道干细胞后，利用生物来源的Matrigel模拟富含层粘连蛋白的隐窝环境，并在细胞培养基中添加外源性生长因子。大多数肠道干细胞能够存活、增殖并形成类器官。然而，由于类器官发育的随机性，由此产生的类器官在大小、芽数和功能上各不相同。在一个如何整合环境因素(机械和生化)来控制类器官形态发生的例子中，将类器官成熟过程分解为不同阶段，并使用生物材料工程来确定每个阶段的最佳机械-化学环境。研究表明，随着时间的推移，可以从高刚度切换到低刚度的机械动态矩阵可以控制形态发生过程。在另一个例子中，人类神经管形态发生通过微模式模拟，创造了机械化学梯度来调节细胞-细胞/基质的相互作用，以及可溶性因子的呈现来协调形态发生。

除了这些例子外，其他工程方法也被用于类器官培养来控制细胞的增殖、分化和形态发生。生物打印是一种流行的重建组织的生物工程方法。该技术使用生物墨水，包括包裹在生物材料中的活体类器官，以逐层方法精确地创建3D生物几何形状，模仿天然组织的几何形状。在最近的一个例子中，生物打印被用于生成大型组织结构，人类小肠类器官被用于形成自我进化的组织结构，这是一个被称为生物打印辅助组织涌现的概念，其中厘米尺度的肠道组织被依次打印以模拟胃肠道的边界。另一种重建组织的生物工程方法，特别是在不同的组织和器官之间，是使用微流控平台。微流体系统已被用于创建包含类器官的微型细胞模型，这些类器官概括了器官生理学的关键方面，被称为器官芯片(OoC)。OoC设备/器件/装置可以潜在地结合其他生物工程技术来模仿器官和组织的关键生理和结构特征。例如，使用合成支架将物理约束设计到类器官环境中以提供物理边界。OoC设备还支持共培养或多器官系统。双器官系统的模拟使用包含不同组织结构的连接腔室来模拟肝损伤(肠上皮细胞和肝细胞)和2型糖尿病(人胰岛和肝球体)。最近，一种双类器官微流控装置被制造出来，该装置使用心脏和肝脏类器官进行多次读出。此外，OoC装置通过支持生理流速，改善了人类ipsc衍生的胰岛、肠、胃和肝脏等器官的特性。肾脏类器官已在OoC装置中培养，该装置使流体流动模拟剪切应力并产生血管网络。

结果

评估培养的类器官是否概括了代表性人体组织或器官的关键方面是很重要的。为了实现这一点，这些类器官的表征通常通过评估类器官的细胞组成、结构、功能和表型的稳健性来进行。在本节中，我们通过代表性的例子讨论常用的分析方法。

类器官有机物组成和结构

类器官生长是细胞初始聚集、增殖、迁移和分化的过程。在评估类器官是否已经成功建立时，关键是首先确定类器官是否包含所需的细胞类型，以及类器官在体内准确模拟相应组织功能的程度。为了实现这一点，通常进行低通量基因表达验证和高通量全基因组转录组分析。实时荧光定量PCR通常首先作为一种简单、快速、定量地读出指示细胞身份的标记基因，包括关键转录因子和分化标记。Western blotting提供了关于蛋白质丰度、蛋白质降解、蛋白质相互作用和翻译后修饰的进一步定量信息，这些信息代表了特定细胞类型中特定信号通路的活性。最常用的评估类器官组成的工具是免疫荧光和免疫组织化学成像，使用切片或整片，特异性细胞标记物的抗体染色进一步阐明了各种细胞类型的空间分布和比例。scRNA-seq的高通量分析在全基因组转录组水平上描述了类器官中的所有细胞类型-未分化和承诺。然后将这些细胞类型与从相应组织或器官中新分离的细胞进行比较，以评估每个细胞群的相似性程度。考虑到体外培养的类器官含有不同状态的未成熟细胞，scRNA-seq可以帮助确定细胞分化状态方面的类器官异质性程度。

进行类器官形态评估，以确定培养的类器官与相应的体内组织或器官之间是否存在结构相似性。例如，对于胰岛等分泌组织，类器官内应存在胰岛样球状结构，细胞内激素囊泡也有望被观察到。对于分支上皮类器官，如乳腺类器官，期望有明显的分支结构。对于肠道类器官，应观察到隐窝样结构。对于更复杂的类器官培养系统，包括合并的支持细胞，如成纤维细胞和/或内皮细胞(ECs)，预计合并的ECs应该形成一个血管网络，概括类器官周围的内皮-上皮相互作用。

类器官功能

类器官功能的评估包括但不限于成熟细胞的产生、脉管系统或神经网络的形成、对外部刺激的准确反应以及细胞因子或激素的有效分泌等因素。类器官应与新鲜分离的组织作阳性对照。不同的组织需要离散的生理重述，如胃类器官的酸分泌和肠类器官的粘液分泌。表1列出了评估类器官结构和功能的各种表征方法。

            表1 类器官研究中评估/表征类器官结构和功能的方法

胰岛类器官

我们以小鼠胰岛类器官为例，讨论了各种表征和验证方法(图3)。通过免疫染色分别检测相应激素(胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽)的表达，检测了四种内分泌分化细胞类型(β-细胞、α-细胞、δ-细胞和PP细胞)的形成。为了评估β细胞成熟的程度，胰岛素分泌颗粒的超微结构形态分析是通过免疫金透射电子显微镜(TEM)成像进行的。为了评估β-细胞对葡萄糖的类器官反应能力，进行了葡萄糖刺激胰岛素分泌实验，例如使用胰岛素或c肽ELISA检测，循环高糖和低糖孵育。由于胰岛素释放与钙动态相关，钙信号示踪成像对葡萄糖的反应迅速增加并返回基线。为了测试移植后胰岛类器官的全部潜力，需要进行体内功能评估，以改善链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型的高血糖表型。表征参数包括正常且稳定的血糖水平、正常的血浆胰岛素水平和维持的体重。

                      图3: 胰岛类器官验证分析的代表性结果

A，培养第7天胰岛类器官的代表性图像。在矩阵中生长的类器官呈球形。高倍镜下，这些球形类器官被内皮细胞(ECs)包围(箭头)。类器官通过疾病从母体释放后的景象。B，通过免疫荧光或免疫组织化学染色验证细胞类型和激素分泌水平。胰岛素(Ins);β-细胞)，胰高血糖素(Gcg;α-细胞)，生长抑素(Sst;δ-cells)和胰多肽(Ppy;在成熟的类器官中可以检测到PP细胞(由DAPI显示;蓝色)。标尺，20 μm。C，经过长时间培养共30天诱导的成熟类器官的形态:类器官被精心设计的EC网络(Ca和Cb部分)所包围，由Cd31(内皮标记物)显示;红色)和DAPI(类器官核;蓝色)染色(Cc部分)。标尺，50 μm。D，部分关键转录因子和分化标记的实时荧光定量PCR分析。E，体外胰岛类器官功能验证。类器官依次用低(2 mM)和高(20 mM)浓度葡萄糖孵育三轮，然后进行c肽ELISA和钙成像。F，类器官分泌c肽测定的代表性ELISA结果。培养基中c肽浓度的升高是对高糖刺激的急剧反应。** p < 0.01;*** p < 0.001。G，钙信号示踪成像强度的代表性曲线，表明类器官对葡萄糖的急性反应能力，高/低钙活性与高/低葡萄糖刺激一致。氯化钾孵育作为阳性对照。H，体内胰岛类器官功能验证。将类器官(或作为阳性对照的新鲜胰岛)移植到链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的肾囊中，监测某些生理指标，表明糖尿病表型得到了挽救。最后，将移植物移除，预计小鼠的血糖水平会飙升，进一步证明移植物是降低血糖水平的原因。

肠道类器官

肠道类器官是最早在体外成功建立的类器官类型之一。经典的隐窝绒毛样结构被认为是成功建立类器官的重要特征，具有适当的分支形态，具有强大的多细胞组成和位置，反映了类器官的分化和成熟水平。Lgr5标记物的表达可以通过实时定量PCR或Lgr5荧光报告仪成像分析肠道干细胞的维持情况。通过标记物的染色来评估分化的细胞，包括溶菌酶(用于Paneth细胞)、绒毛蛋白(用于肠细胞)、粘蛋白2(用于杯状细胞)和嗜铬粒蛋白A(用于肠内分泌细胞)。这些不同的细胞类型也可以通过透射电镜根据它们特有的亚细胞结构来区分。由于成熟的杯状细胞分泌粘液，功能性肠道类器官表现出相对较厚的黏液层，可通过阿利新蓝和周期性酸-希夫染色检测。

肝脏类器官

在肝脏的情况下，已经从小鼠和人类组织样本中建立了胆管细胞和肝细胞类器官。通过测量类器官细胞的传代时间和增殖来评估肝类器官。在标志物表达方面，从RNA水平(实时定量PCR、scRNA-seq)和蛋白质水平(免疫荧光染色)两方面评估特异性胆管细胞(如KRT19、KRT7、SOX9)或肝细胞(如ALB、HNF4A、MRP4)标志物。通常，肝祖细胞的标志物(如LGR5)也被用来评估培养细胞的分化状态。为了评估类器官功能，进一步在RNA水平上分析肝细胞的CYP3A4和CYP3A11等标志物。此外，白蛋白分泌、低密度脂蛋白摄取、定期酸希夫染色评估糖原积累的存在、胆汁酸产生和肝酶(如CYP3A4)的活性使用化学测定来确认肝细胞功能。类器官的超微结构也经常通过透射电镜评估典型的肝细胞或胆管细胞形态。最后，为了最终测试功能，类器官通常被移植到FRG免疫缺陷小鼠中，以观察移植物在体内的整合和功能。

肿瘤类器官的验证

患者来源的肿瘤类器官必须保持起源组织的基因组、转录组学、形态学和功能特征。因此，在组织学和免疫组化谱、转录组学和基因组学方面，通过与来源于它们的组织进行比较来验证它们是很重要的。肿瘤类器官的细胞组织、组织结构和蛋白质表达模式可以很容易地与原发癌进行比较。类似地，类器官的基因表达谱与它们赖以形成的肿瘤相似。这已经通过RNA-seq在许多类型的肿瘤上得到证实，包括膀胱癌和食管癌等等。最后，确认肿瘤类器官是否在基因组水平上偏离患者肿瘤是很重要的。一些研究表明，在突变和拷贝数变异方面，类器官和亲本组织是一致的。更大程度的差异可能归因于肿瘤内部的空间异质性和抽样偏差:肿瘤可能具有空间多样性，而从特定部分产生的类器官可能缺乏遥远地区的代表性。除了这个地形问题，培养条件可以帮助选择特定的克隆，可能随着时间的推移改变或减少克隆性。

当长时间培养时，肿瘤类器官的验证更为关键。虽然一些研究报道分子特征可以在长期培养中保持，但其他研究则观察到连续传代后肿瘤的进化。例如，肝癌类器官的外显子组测序显示，突变一致性从培养少于2个月的类器官的92%下降到培养超过4个月的80% 。从微卫星不稳定肿瘤中建立的结直肠肿瘤类器官在长期培养后比稳定肿瘤有更高的新生突变。观察到的一些差异可能归因于不同的无性系和亚无性系如何在培养中适应和扩展。通过对500个癌症相关基因进行深度靶向测序，研究人员发现保留了截断突变，而获得或丢失了亚克隆突变，每个通道都发生了突变126。大多数突变和拷贝数变异在肺癌类器官传代后期得以保留，而新生突变可归因于原肿瘤中存在的一小部分细胞的亚克隆扩增。总的来说，这些研究表明遗传漂变可能发生在长时间培养的类器官中，影响其作为功能和药物发现研究模型的可靠性。这重申了在肿瘤类器官建立、表征和测试的背景下验证的重要性。作为分析的一个例子，展示了肝癌类器官表征的关键步骤(图4)。最后，正常组织污染是建立肿瘤类器官的一个问题，在验证患者来源的模型时应予以解决。正常细胞的存在可以通过组织学比较和免疫组织化学以及测序来估计。

                      图4: 肿瘤类器官的典型特征:肝癌亚型

a，从患者样本和类器官培养中分离细胞，并附有组织分离和处理示意图。b，肝癌样本的组织学分析。上行为组织(比例尺:50 μm)，中行为类器官亮场图像(比例尺:100 μm)，下两行为类器官的组织学血红素和伊红(H&E)染色(比例尺:50 μm)。c、特异性标记基因表达分析，包括AFP(肝细胞/肝细胞癌)标记物的免疫荧光染色;红色)和EpCAM(导管/胆管癌(CC)标志物;绿色)。DAPI染色为蓝色。比例尺:30μm。d, Organoid传代为生长和分裂曲线，其中圆点表示分裂时间点，箭头表示持续扩张。e，异种移植物移植到免疫缺陷小鼠体内。异种移植和组织病理学分析，与患者原始组织样本相匹配。比例尺尺寸:125 μm，插入尺寸:62.5 μm。f，分析癌症类器官的遗传变化及其与原始肿瘤样本中突变的一致性。g，吉西他滨治疗的半最大抑制浓度(IC50)曲线显示对药物的类器官敏感性。CHC, HCC/CC合并肿瘤;原发性肝癌PLC;SC,皮下。

数据分析
图像处理与分析

图像处理采用ImageJ/Fiji134、CellProfiler等软件。在一定时期内形成的类器官的数量、类器官的大小(以面积或体积衡量)和细胞数量可以衡量细胞的增殖速度。使用可用的软件插件，可以通过edu阳性或ki67阳性细胞核的比例来定量细胞增殖。考虑到功能成熟度，在量化成功率时，形态学评估(如肠类器官系统的芽形成率)也是必要的。可以记录不同组织类型成熟标记物的平均和/或归一化荧光强度，以测量类器官的成熟水平。长期的实时成像可以使用软件来跟踪细胞行为，以进行谱系追踪。利用网络资源对多组学数据进行通路分析和可视化，生成热图，以了解organoid的分化阶段。其他软件，如Profiler、GSEA、Cytoscape和enrichment map，已被用于生物分子相互作用网络、途径富集分析和可视化。

表型的数据分析分类

使用机器学习和基于人工智能的数据分析的小型化和自动化使类器官的高通量和多维表型更加一致。近年来开发了各种用于这些目的的软件，包括ilastik, OrganoidTracer和Phindr3D。其中大多数都有斐济或CellProfiler插件，这使得没有大量计算专业知识的用户可以在更短的时间内处理大型数据集。这些软件通常包含图像分割、对象分类、形态表征、荧光强度定量、细胞计数和数百张图像跟踪等功能。良好的图像质量是鲁棒性结果的先决条件，因此优化图像采集过程至关重要。在数据处理的不同阶段，建议验证训练算法的准确性。

应用

类器官作为一种以细胞为基础的工程模型，可以概括相关的生理结构和功能，在基础研究和临床应用中都显示出巨大的潜力。在这里，我们总结几个应用。

组织再生

组织来源的类器官可能是再生医学可移植材料的潜在来源。小鼠的肠道、肝脏和胰腺类器官已成功移植到小鼠体内，并恢复了器官功能。例如，肝类器官已经从小鼠肝脏分离的肝细胞中产生。这些类器官被注射到富马酰乙酸水解酶(Fah)缺乏的小鼠体内，这种缺陷会导致肝损伤，在用保护肝的尼替西酮(nitisinone)药物治疗后存活时间短(40天)。类器官移植率高达80%，移植小鼠在尼替西酮治疗中断后存活时间超过100天。同样，在人工ECM中培养的胰岛可以成功地移植到链脲佐菌素诱导的或自身免疫驱动的糖尿病小鼠模型中，挽救胰岛素的产生并逆转高血糖。除了小鼠类器官外，从肝脏样本中提取的EpCAM+导管细胞衍生的人类肝脏类器官已被移植到急性肝损伤的免疫缺陷小鼠中。人类胰腺类器官可以由ALDHhigh干细胞产生，并且具有产生胰岛素的潜力，但尚未有体内证据证实其移植。肠道类器官已被证明融合成类似体内肠道的管状结构。更复杂的肠道类器官也可以在具有可调节生物降解性的人工ECM中生成。尽管将类器官用于再生医学还有很长的路要走，但是已经建立了生成正常组织类器官的改进方案、确保高可重复性、移植和功能的良好制造规范。

药物发现和开发研究

近年来，快速和高通量3D类器官筛选的技术挑战已经得到解决，并通过不同的手段超越，包括替代板设计或播种几何形状。对来自卵巢或腹膜肿瘤患者的类器官的240种酪氨酸激酶抑制剂进行筛选，在手术后一周内提供个体化药物敏感性资料。该研究包括一种卵巢癌肉瘤，这是一种散发性卵巢癌，目前尚无一线治疗方法。肿瘤类器官可以通过筛选从结构相似的候选药物中选择有效药物，并研究不同药物联合治疗的协同效应。活检样本或手术切除样本中邻近正常组织的非肿瘤细胞可用于培养对照健康类器官，以确认所测试药物的肿瘤特异性功效。类器官可以用免疫细胞文库筛选，这些免疫细胞经过工程改造，表达针对不同新抗原的嵌合抗原受体。检查点抑制剂和其他免疫肿瘤药物也可以在包括免疫细胞在内的肿瘤类器官模型中筛选。

生物标志物的研究

由于类器官可以维持亲本组织的基因组图谱，药物筛选可用于提供基因突变和药物反应之间的联系。通过对7名患者的胃癌类器官进行37种药物的筛选，ARID1A突变的肿瘤被证明对ATR抑制剂敏感，这支持了先前的研究，并在功能上确定了对一类被认为不可药物的突变的干预措施。

精准医疗应用

人们对为每位患者量身定制癌症治疗越来越感兴趣。精准医学常常是基因组学的同义词。然而，正如几项临床试验所显示的那样，只有一小部分患者具有可操作的改变，可以结合特定的干预措施。在评估大规模实施测序驱动疗法的NCI-MATCH试验中，只有大约37%的患者被发现具有可操作的突变。这项和其他精准医学试验表明，许多有针对性的干预措施的临床效益有限，反应率适中，揭示了很大程度的复杂性。例如，SHIVA试验比较了基因组引导干预与肿瘤学家选择的常规治疗方法对大量预处理的癌症患者的结果，结果显示无进展生存没有差异。尽管基于基因组学的精准医学干预的临床疗效存在争议，但很明显，大多数癌症患者没有可靶向的基因来指导治疗。功能精准医学——基于测试患者肿瘤的药物反应来确定治疗方案——已经被提议作为一种更直接的替代方案，因为它不需要任何关于肿瘤分子特征或其他特征的先验知识。类器官是功能精准医学的理想选择，因为它们易于建立，与原始组织高度相似，易于处理，并已被用于识别许多肿瘤的治疗先导，包括那些往往在分子水平上研究不足和特征不佳的罕见癌症。最近，从患者来源的异种移植物中建立的类器官被用于鉴定伊瑞布林对复发性三阴性乳腺癌患者的治疗。患者的无进展生存期在伊瑞布林治疗方案中比之前的治疗方案长3.5倍，表明类器官在临床护理中的潜力。

异种移植物的来源材料

类器官越来越多地被用作种子材料，以产生具有着陆率的异种移植物。这个过程包括使用完整的类器官或消化后的单个细胞。将携带APC、SMAD4、TP53、KRAS和/或PIK3CA突变的CRISPR-Cas9转化的人肠道类器官植入免疫功能低下小鼠的包膜下肾间隙。携带一个或两个基因突变的良性类器官不能形成肿瘤，而携带四个或五个基因突变的类器官具有致瘤性。

患者来源的类器官也可以产生异种移植物，证实其致瘤能力，并概括亲代肿瘤的组织学。在一项结肠直肠癌的研究中，良性肿瘤类器官在小鼠体内没有或只有很小的植入。相比之下，来自转移的结直肠癌类器官比来自原发肿瘤的类器官更具侵袭性。由胶质母细胞瘤多形性细胞形成的异种移植物的形态比较，无论是作为肿瘤球体还是作为类器官，肿瘤球体的细胞表现为固体生长模式，而类器官更具有弥漫性，类似于原始肿瘤。来源于膀胱管腔肿瘤的类器官系移植到小鼠体内后，可产生具有相同管腔表型的肿瘤。

传染病

类器官模型已广泛应用于宿主-病原体相互作用的研究。例如，从组织和器官中提取的类器官，如肠、肝、肺、口腔黏膜和胃，已与细菌、病毒和寄生虫等病原体共同培养。在人类肠道类器官中，分化的肠细胞比未分化的肠细胞更容易感染人轮状病毒(HRV)。感染HRV或轮状病毒肠毒素的类器官表现出肠腔肿胀，这是轮状病毒引起的腹泻的一个特征。以人肝类器官为药物筛选平台，检测抗HRV药物和抗体，鉴定出能够阻断轮状病毒体外复制的霉酚酸、IFNγ和抗轮状病毒VP7抗体。类器官也可用于致癌病原体的研究。幽门螺杆菌感染小鼠胃类器官时，细菌源性CagA诱导的胞浆β-catenin水平升高，导致感染的类器官增殖增加。

自COVID-19大流行开始以来，几个实验室研究了SARS-CoV-2病毒对类器官的影响。用表达ace2的管腔细胞生成了可感染sars - cov -2的远端肺类器官。研究发现，SARS-CoV-2的目标是杯状细胞，而不是纤毛虫细胞，这与之前在二维空气-液体界面模型中的研究形成了对比。对肠道类器官的研究表明，SARS-CoV-2也可以感染肠细胞，CRISPR-Cas9和药物筛选表明，敲除TMPRSS2或TMPRSS4，或用卡莫司他治疗，都可以减少病毒感染。

常见病和罕见病生物学

类器官在模拟和研究由各种不同器官引起的常见和罕见疾病方面已显示出重要的效用。囊性纤维化是一种由CFTR基因突变引起的遗传性疾病，CFTR基因表达一种跨膜氯化物和碳酸氢盐转运体。据报道，有超过2000个与囊性纤维化相关的CFTR突变，但临床上部署的小分子治疗仅针对其中的一个子集。CFTR突变可引起多器官功能障碍，影响肺、胰腺、肝脏和肠道。结肠、肝脏和胆管、直肠、呼吸系统和小肠的囊性纤维化类器官模型已经从小鼠模型或患者的相关器官的成体干细胞中获得，其应用范围从研究疾病生物学到反映患者的药物反应。Forskolin是一种CFTR激活剂，已被用于诱导由于氯化物和流体流入管腔而引起的类器官肿胀，患者来源的直肠类器官肿胀减少与患者的临床反应参数相关，这可以模拟对特定治疗方案的个性化临床反应。囊性纤维化类器官也被用于研究基因治疗干预措施，并能够利用CRISPR-Cas9挽救CFTR突变在肠道类器官中的作用。

炎症性肠病，如溃疡性结肠炎和克罗恩病也用类器官模型进行了研究。炎症性肠病患者的肠道上皮细胞衍生的类器官具有炎症性肠病特异性的DNA甲基化特征，尽管保持相似的形态。生成肝脏类器官来模拟肝脏疾病，如α - 1抗胰蛋白酶缺乏症、Alagille综合征35和原发性硬化性胆管炎。已经建立了肺类器官来研究杯状细胞化生等疾病。

再现性和数据积累
异质性和可重复性

类器官在形成类器官的细胞之间(类器官内异质性)、同一培养皿中的类器官之间以及个体患者之间(类器官间异质性)表现出异质性和可变性。这种异质性对于概括个体之间的差异是有价值的，特别是在人类疾病的背景下，并且在癌症研究中对于模拟个性化医疗的患者特异性癌症发展是有价值的。类似地，类器官内变异反映了组织细胞组成的复杂性。这有利于模拟组织发育或再生，细胞形成包含不同细胞状态的类器官，从干细胞/祖细胞到更分化的细胞。尽管这些水平的变异和异质性反映了生物系统的复杂性，但如果不加以控制，它们可能会危及系统的可重复性和稳健性。

形态和功能甚至类器官形成效率的显著差异取决于培养物的不同来源细胞或类器官中的不同细胞，以及不同的培养基组成。关于细胞来源，用于产生起始培养的iPSCs/多能干细胞的批次和质量会影响所获得的类器官系的变异性。同样，从不同动物或病人身上分离出的不同原代细胞也会影响随后的培养。培养基通常是为细胞增殖而优化的，而向某些细胞命运的分化在很大程度上受培养条件的影响，从而增加了变异性和异质性。培养条件的改善已被证明可以增加人小肠类器官中分化细胞命运的多样性。未定义的ECM(如Matrigel)具有未知的成分和批次间的可变性，使再现性成为一个重要问题。在研究类器官发育过程中的转录组变化或研究类器官传代过程中的基因表达变化时，另一个重要因素变得显而易见。当类器官模拟发育时，这些变化可能导致混淆效应，例如，时间异质性。因此，在文化中记录通道和时间对于确定影响结果的变异来源至关重要。

为了更好地理解和控制异质性，该领域已经从大量分析转向使用单细胞方法，如scRNA-seq，以帮助描述不同的类器官形成细胞群。许多单细胞分辨率的数据集正在出现，其中有几个值得注意的例子是更均匀的类器官生产和在生长过程中解决类器官异质性。汇集不同的细胞和/或类器官进行批量分析可能导致不准确的结果。因此，对实验中收集到的数据进行良好的记录对于得出可靠的结论至关重要。

此外，随着油田复杂性的增加，减少可变性和异质性的来源是至关重要的。努力产生包含不同细胞群的更完整的类器官结构——例如最近发表的内皮和健康的人类结肠癌和人类结直肠癌类器官，小鼠胆管细胞和间充质类器官，以及小鼠胰岛和内皮类器官——将需要控制变异来源，这些变异来源于将额外的细胞纳入已经异质的系统。在产生更多功能相关结构的同时对变异进行控制是该领域面临的重大挑战。

最后，在类器官治疗后也观察到显著的异质性。虽然这在试图使用类器官作为研究分子机制的工具时是一个缺点，但在旨在模拟患者反应时是有益的。特别是，对于癌症治疗，几种不同的患者来源的类器官模型(包括但不限于胰腺、结直肠癌和肝癌)对已知的化疗和抗癌药物表现出异质反应。这与临床观察到的患者结果的可变性相似，并将癌症类器官定位为药物测试的潜在预测工具。这种治疗反应的异质性目前正被用于治疗囊性纤维化患者，由hit -囊性纤维化联盟领导的一项大型欧洲多中心临床试验正在进行中，以确定潜在的应答者。类似的举措对癌症患者来说是滞后的，尽管主要是因为建立率的差异和漫长的时间表。类器官最近被用于治疗一种罕见的肝癌患者，但不幸的是，由于患者的一般情况恶化，治疗停止，使作者无法得出关于类器官系统对药物治疗的预测价值的结论。

最低报告标准

为了提高结果的可重复性和可靠性，必须考虑不同细胞分离和类器官内异质性之间的可变性。虽然人们可以认为至少三个独立的实验，至少三个不同的生物复制是最低要求，但这可能并不总是足够的。事实上，每个生物重复研究的类器官数量以及生物重复的数量取决于研究问题、具体实验和观察到的表型的可变性。在可能的情况下，强烈建议计算每个生物重复的独立类器官的数量，类似于用于小鼠实验的样本量计算，并考虑到实验的统计能力和方差。数据应该是稳健的，这意味着在至少三个独立的生物重复中重复，这是指从不同的动物或患者中独立分离。但应提前确定每个实验的重复和研究问题，避免捞假设和增加重复，以获得条件之间的显著性。数据应正确地报告为每个重复的平均值，每个重复是相似数量的类器官的平均值。最近，一些出版物提供了提高可重复性的指导方针，包括一般的生物报告和准确的统计。SuperPlots推荐用于数据可视化，因为它既显示了每个独立生物复制的平均值，也显示了单个数据点的分布。这种类型的图是理想的类器官报告，因为它可以立即可视化有关批次变化的任何潜在人工制品。期刊收藏加深了生物科学中使用的统计学的各个方面，是促进准确报告的宝贵资源。

类器官应充分表征，不仅要检查标记物的表达，还要以起源组织为基准。至关重要的是，不仅要确定细胞是否具有与起源组织相似的形态和表达模式，而且要确定它们具有相似的功能(例如，使用ELISA检测肝脏/肝细胞类器官产生的白蛋白、胆汁酸)。只要有可能，比较条件之间的结果应根据DNA含量(用于基因组分析)或结构蛋白(如肌动蛋白，用于western blotting)进行归一化，而来自ELISA的功能数据应归一化为每个孔中被比较的细胞总数或类器官结构面积。改进报告标准是提高可重复性的第一步，从而使该领域能够向前发展。

数据积累

标准化的类器官数据库目前尚不存在。一个值得注意的例外是由美国国家癌症研究所(NCI)和人类癌症模型倡议(HCMI)领导的患者衍生的癌症类器官库。然而，健康的患者来源的类器官和非癌症疾病的类器官模型，包括人类和小鼠，尚未在一个数据库中记录，这表明显然需要完整地记录、报告和保存所产生的所有类器官系。最近启动的人类细胞图谱-类器官计划(Human Cell Atlas-Organoid initiative)记录了所有源自人类的类器官，是朝着这个方向迈出的第一步。对于转录组学相关的数据，如基因表达、非编码RNA、ChIP、基因组甲基化、高通量PCR逆转录、SNP阵列、SAGE和蛋白质阵列，通常推荐使用gene expression Omnibus (GEO) 。对于用于分析类器官数据集的代码，建议使用GitHub。我们设想，数据和类器官库将很快出现，以填补目前在类器官工作数据存储库中缺失的空白。当存储来自人类类器官的数据时，重要的是要考虑所有伦理法规以及获得患者同意和保持患者匿名的必要性。其他地方已对临界点进行了广泛审查。

在类器官命名法上也缺乏共识。除了一些值得注意的例子，如肠、肝和胰腺的领导者对肠道、肝脏、胰腺和胆道类器官的命名进行了讨论外，该领域正在等待一个更明确定义的命名系统。

限制和优化

获得的三维类器官系统在形态和功能上的可重复性仍然是一个主要的瓶颈。在本节中，我们详细阐述了类器官研究的局限性和最新进展，为开发、表征和基准化类器官系统提供了一条更优化的途径。

有限的成熟度和功能

目前的类器官模型系统没有一个能再现其各自器官的细胞类型、成熟水平和/或功能的完整生理库;相反，它们表现出它们主要形成的组织的某些功能。绝大多数组织源性类器官模型缺少组织特异性细胞类型，包括小生境特异性间充质、免疫细胞、血管化、神经支配或微生物组。最近，导管细胞-肝间充质细胞共培养已被证明再现了部分肝门静脉结构。特别具有挑战性的是，并非所有细胞类型都具有相同的增殖速率，生长因子需求甚至氧暴露需求(血管缺氧)。多能干细胞衍生的类器官能更好地概括不同类型的细胞和发育器官的细胞相互作用，但不能表现成体组织的结构和功能，以及细胞成熟。一种有效的策略是体内移植。然而，这是以放弃对形成的组织结构的控制为代价的。同时，对分化协议进行优化，以丰富成熟和感兴趣的特定功能。

另一个导致成熟和功能受限的因素是营养物质的可及性和死细胞在空心管内的积累。这对于iPSC衍生的类器官尤其重要。随着类器官的增大，位于类器官中心的细胞的营养供应受到限制，导致细胞死亡。这在结构更紧凑的类器官中很常见，比如大脑类器官。对于形成中空囊肿的组织源性类器官(胆管细胞，胰腺)，死细胞最终将开始在其腔内积聚，这是不可避免的，但可以通过类器官的机械破碎来解决。已形成结构的不断破碎阻碍了长期研究的开展。然而，多能干细胞衍生的类器官不能破碎和传代;解决营养可及性问题的新策略正在开发中，包括在体外长期维持脑切片。

异质性的有限控制

一旦细胞形成类器官，我们对类器官内细胞行为的输入就会减少。即使在相同的实验环境中，结果往往是过多的表型特征(形状，大小，细胞组成)，而不是刻板的培养。优化形态发生梯度、组织特异性细胞- ECM相互作用以及局部生化和生物物理特性对于减少批间异质性至关重要。

为了产生更复杂的多细胞成熟和功能结构，类器官领域已经开始创造组装体，如人类皮质-运动组装体。这样的努力可以创造出更复杂的结构，用一个明确的界面连接多种类型的组织，比如用神经-肌肉连接连接大脑皮层、脊柱和骨骼肌，但代价是可重复性。正如最近另一篇关于肝脏、胆道和胰腺类器官的综述所讨论的那样，多细胞和多组织类器官系统的可重复性降低，因为协调多种细胞类型的增殖和分化具有挑战性。

对类器官内异质性的有限控制不利于高通量筛选应用，并使需要高时空分辨率成像的研究变得困难。与其创造更复杂的类器官系统，不如用更简单的降维模型来概括重要的组织结构和功能。ECM组合的变体，微图案的2D单培养或共培养，细胞片，堆叠的3D结构25和微定位的ECM基板允许形成具有高度时空控制的可复制组织结构和功能，如拉伸和渗透力(图5)。

                         图5: 通过降低复杂性来降低异质性

a - c，类器官发育过程包括初始2D条件的形成(a部分)，生长成3D结构(b部分)和组织形态发生(c部分)。d,e，简化的模型来概括基本的组织结构和感兴趣的功能正在获得动力。微图案2D单培养或共培养允许形成可复制的初始2D条件，该条件可进一步形成初始3D结构。例如，隐窝的形成可以通过局部基质软化来控制，几何结构可以诱导中心区域的肠细胞(L-FABP染色)和芽区增殖的LGR5细胞的模式分化(d部分)。随后，高度的时空控制可以应用于指导某些组织形态发生。例如，神经细胞分化模式可通过拉伸幅度和时间调节242。图表示从0到100%的拉伸幅度，散点(S)和图案(P)是分化图案的两种构型。f、渗透力可以控制肠道类器官的隐窝形态243。比例尺:30 μm (d部分)、50 μm (e、f部分)。Blebb blebbistatin;hNTO，人神经管类器官;PGE，前列腺素E2。

优化ECM成分

已经实施了工程方法来优化这些限制(图6)。克服使用非特异性ECM(如Matrigel)的主要途径有两种:一种是使用对成分和刚度具有更完全控制的合成基质，另一种是采用脱细胞组织并创建组织特异性基质。鉴别化学定义的、与GMP兼容的ECM，使人类类器官的生长和长期扩张取得了重大进展。在这方面，人类胰腺类器官、肠道类器官和结肠直肠癌类器官取得了一些进展，这些器官可以在基于葡聚糖的完全定义的ECM中生长;然而，它们不会长期扩张。

    图6: 目前类器官培养的局限性和克服这些局限性的方法的并排比较

a，囊性类器官腔内死细胞和细胞碎片的积累(左)已经通过设计可灌注的开放式结构(右)来克服，该结构使用诱导流来冲洗细胞碎片，这与长期实验更相容。b，在Matrigel穹顶中生长的类器官显示出细胞异质性和形态的高度可变性(左)，这可以通过使用具有图案合成细胞外基质(ECM)的网格(右)来克服，该网格为细胞分化提供线索。这些平台还与高通量筛选兼容。c，单细胞类型衍生的类器官不能概括天然组织的细胞和生理复杂性(左图)，但将类器官与器官芯片(OoC)结合(右图)作为一种新技术，将能够创建适合多种细胞类型的受控微环境。

类器官与器官芯片相遇

研究表明，通过在灌注可溶性微环境中最大化传质和最小化剪切应力，在OoC环境中生长的细胞上调了它们的功能，更接近天然组织。最近的一个例子表明，液体流动的存在如何促进体外肾类器官的成熟并促进其血管化。通过在相同大小的隐窝中自组织的工程支架，将物理约束设计到类器官环境和肠细胞中。同时，他们克服了囊性类器官的不可接近性和细胞碎片的清除，创造了一种可灌注培养的小肠，其中细胞排列形成管状上皮和与体内组织相似的空间排列。

前景

展望未来，趋势是开发更复杂的模型，尽可能忠实地概括体内的结构和功能，根据概括细胞类型随时间的变化，组织结构，可测量的分子事件和表型功能。与其只关注最突出的标记或功能分析，还应该对原生组织进行架构基准测试。在肝细胞类器官的例子中，肝细胞的功能得以保留，但肝组织结构与肝细胞排列成索状的天然组织不匹配。类似地，类器官如胰腺癌或结肠癌的类器官也呈各向同性生长，形成囊肿，而不是它们在原生组织中形成的管状结构。为了获得更复杂的功能，具有多细胞和多组织结构的类器官将是重要的，特别是在研究细胞-细胞相互作用的背景下。沿着这条脉络，组装体和芯片上的器官也变得越来越复杂，被越来越广泛地采用。

另一方面，工程师的方法是追求由驱动感兴趣的复杂细胞或组织功能的最小功能模块定义的更简单的还原论模型，研究发育或修复中的机械生物学因果关系，或开发用于高通量筛选的强大系统。基本前提是，复杂的生物功能是通过有限数量的功能模块的协调操作来执行的，每个功能模块由一小组分子描述，化学反应驱动中尺度(亚细胞或细胞间组织/多细胞)结构与特定时空阶段/阶段/步骤中感兴趣的功能相关的物理属性变化。例如，肝脏中的胆管表现出每小时扩张和收缩的周期。为了高分辨率地研究引起性收缩事件，仅在邻近肝细胞整个调节机制的背景下直接研究形成胆管的邻近肝细胞区域。人们可以选择创建一个包含胆管细胞的更大的结构，而不是由最小功能模块操作的结构，但该模型将是嘈杂和昂贵的。每个功能模块都耦合到另一个模块，可以一起建模，也可以在不同的长度尺度上独立建模。简单的还原论模型对于组织形态发生事件如缺陷的高分辨率机制理解是有用的。

从几何上限制初始2D播种模式和3D形成的大小，并使用Matrigel支持3D细胞生长，可以诱导组织样神经管形态发生并生产高度可复制的神经管。这也允许识别神经管折叠的机制和模拟神经管缺陷。在另一个例子中，细胞均匀球体的对称性破坏和Paneth细胞的出现是肠道类器官形成早期的关键事件。其机制最近被阐明:对称破缺是由机械传感器YAP1的瞬时激活引起的，YAP1诱导NOTCH-DLL1侧向抑制事件。YAP1的激活已经通过在水凝胶支架中施加几何约束来控制，并产生均匀且可复制的肠道微组织。

类器官可以通过减少2.5D培养中的第三维来限制。2.5D培养降低了典型类器官的深度驱动变异:低氧核心的扩散限制，药物/转染剂的可及性受限以及成像透明度受限。三维限制的典型例子包括在弯曲或有图案的表面上培养细胞，一个扁平或受限的细胞结构，并以高合流的方式将ECM覆盖在扁平的细胞单层上，这将使细胞向上拉，迫使更多的细胞-细胞相互作用采用3D细胞形态。胶原夹心中的肝细胞有足够的接触面积来获得极性，并形成一个与体内相同的周期收缩的胆管腔，没有3D网络，与天然组织相比更宽，胆汁淤积。这种基于细胞的模型能够高分辨率地解剖胆管收缩的机制，并了解调节相变的分子机制。我们还可以设想更多基于crispr编辑细胞的工程类器官模型，用于疾病建模，尽管这些细胞和模型是合成的。

除了在创造更多生理相关、健壮和易于使用的类器官模型方面的技术进步外，我们还设想在应用中看到更大的影响。在过去的二十年里，虽然有关于取代动物实验的讨论，但这些努力还没有导致具体的行动。然而，这种情况正在迅速改变，监管机构现在在多个领域建立了硬性限制。类器官可以在体内重现复杂的生理功能，这也增强了人们的信心，即新的替代方法现在是可行的选择。将有更多的动物研究结果外推到人类类器官中，以更好地了解人类生物学和病理生理学。我们设想广泛采用类器官作为细胞治疗、再生医学、体外诊断和药物发现的细胞来源。


参考文献：
Zhao, Z., Chen, X., Dowbaj, A.M. et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers 2, 94 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00174-y

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