用于微生物学中基于液滴的应用的组合样品制备平台

Make the experiment run accurately and stably

亮点：
? 介绍了一种自动化的组合样品制备平台，可根据需要合并和混合试剂。
? 可实现多达169种颜色编码的组合用于生成液滴。
? 开发了一种稳健的机器学习算法，可高效分析液滴群体。
? 该平台已成功应用于抗生素敏感性检测。

液滴微流控由于其独特的特点，如小型化、区室化和并行化，在微生物研究中表现出了巨大的潜力。多重液滴内容允许以高度并行的方式研究各种实验条件。然而，液滴库的生成和跟踪在高通量筛选中仍然具有挑战性。将不同的试剂引入液滴中需要精确控制微流控芯片中的液滴流动，从而限制了几种试剂的吞吐量。此外，由于其快速动态，跟踪单个液滴非常复杂。为了应对这些挑战，我们开发了一个用于自动样品制备的多重平台，能够按需合并和混合试剂，以微调液滴生成的样品成分。通过将四种荧光染料在六种浓度水平下成对组合，可以实现具有 169 个光学条形码的编码空间，以根据实验设计的要求对液滴群进行编码。机器学习算法已被用来识别不同的液滴群。作为概念证明，我们对一种菌株进行了抗生素敏感性测定，以筛选四种抗生素的敏感性，并在一个实验中确定最低抑制浓度。利用按需样品制备、光学条形码和机器学习分析，我们的设置为众多微生物和生化应用提供了快速、简单且可靠的多重分析能力。

基于液滴的微流控技术在过去十年中备受关注，因为它具有几个独特的优势。利用该技术，可以每秒产生数千个高度单分散的液滴。高生成率使其成为高通量和并行实验的理想方法。液滴的体积可以从皮升至纳升，这大大降低了高通量应用中的试剂消耗和成本。此外，高表面积与体积比有助于加快反应速度。凭借这些独特的特性，基于液滴的微流控技术已经展现出在各种科学和医学领域中进行高通量筛选应用方面巨大潜力。

液滴在微生物学应用中也被广泛用于高通量筛选，包括酶活性、抗生素耐药性和药物的组合研究。对于这样的实验，通常需要或有必要研究多个实验条件。这同时带来了筛选过程中的关键优势，如时间效率、增加通量和减少实验变异。所需的条件可能是不同的分析物浓度、底物、培养基组成或缓冲液等。然而，在高通量筛选中，液滴库生成和内容跟踪仍然是关键挑战。在基于液滴的微流控平台上进行多重实验条件需要开发复杂的过程控制、流体处理和分析管道，因为这些平台占地面积较小，并且样品在其中传输速度快。

在微流控芯片中引入不同的化学成分到液滴中需要对液滴流动进行精确控制。这限制了可以处理的试剂通量，因为过程动态需要与液滴生成或再注入相匹配。快速的动态过程也使得跟踪液滴内容并使其回到实验条件下成为一项具有挑战性的任务。已经有研究针对组合筛选应用进行了相关研究。在某些方法中，在液滴生成之前进行多重样本制备步骤，然后将准备好的样本注入一个或多个微流控芯片以生成液滴。还有基于梯度的方法，通过多个进样口将不同的溶液注入微流控芯片以生成具有不同条件的液滴。然而，这些方法要么需要在液滴生成之前进行耗时的准备过程，要么需要随着试剂数量增加而增加精确流体控制单元。因此，随着为额外实验条件添加新试剂，样品制备时间和复杂性将增加，并且会限制组合处理通量、增加样本变异性、降低样本重现性（这在微生物学实验中是一个很大挑战）。

为了可靠地区分不同菌群的液滴内容，人们开发了多种编码策略。在一些光学条形码策略中，在样品制备步骤中使用特定浓度的荧光染料来对不同菌群进行编码。另一种光学条形码方法是使用彩色或荧光标记的珠粒或量子点。另一种方法是基于核酸的条形码，它将条形码与液滴内容的遗传物质联系起来。尽管这些方法可以实现大规模检测，但它们并不能完全满足需求，尤其是在微生物学中对按需组合应用的需求。此外，在基于核酸的条形码的情况下，需要进行测序，这反过来又需要破滴和复杂的分析步骤。最近，开发了一种集成微流控芯片设计，通过使用阀门控制层来实现对抗生素敏感性测试的自动化样品制备。使用该集成芯片和四种不同的药物，可以测试16种条件。然而增加更多试剂入口会增加设计复杂度，并使不同试剂之间受控合并和混合成为具有挑战性任务。此外，在该平台上追踪液滴时采用顺序方式进行操作, 这使得它们容易在芯片内受到干扰。因此，在微生物学应用方面, 该平台存在局限性, 因为无法在芯片外培养更大数量液滴。

在这项工作中，我们提出了一种用于按需多路复用样品制备的多路复用平台，以进行组合皮升滴液生成。该平台通过自动化样品插头生成直接输入到皮升滴液生成中。在滴液生成之前，最多可将8种试剂的样品插头有效地合并和混合，以产生均匀的多重混合群体。重要的是，由于只使用单个微流控芯片，因此引入了清洗插头来确保无污染的滴液生产。我们采用了光学条形码策略来编码滴液群体的内容，利用荧光染料组合可以生成高达169种潜在代码，并使用机器学习方法进行解码。为了展示该平台对微生物学应用的适用性，我们对模型菌株针对四种抗生素进行了25种不同条件下的多重抗性检测。我们展示了在单次实验运行中，在培养8小时内完成敏感抗生素鉴定并确定其最小抑菌浓度的能力。

多重化平台的搭建与运行
如图1所示，通过以下三个主要步骤（步骤1至步骤3）可实现对样本插头的按需自动化多重化，以生成液滴。在第一步中，我们使用商用液体处理器（Mitos-Dropix Dolomite）生产所需体积的插头。该液体处理器具有油箱、可装载多达50 μL试剂的24个样本孔条带以及连接到注射泵的样品钩。样品钩在设备控制软件定义的孔之间移动，并进入每个孔，以抽取所需的插头体积（如图1所示）。抽取的最小体积取决于工作流速和样品钩管的内径（ID）。在我们的设置中，使用了内径为0.25 mm的样品钩管。该管连接到内径为1.5 mm的管子（如图1所示），用于存储和合并插头步骤。在第二步中，将合并具有不同内容的两个或多个插头。对于具有足够接近油间距的两个插头，从窄管配置过渡到宽管配置将导致合并。这是在带有扩展室的微流控芯片中出现的一种已知现象。我们使用三通阀将两个具有不同内径（0.25毫米和1.5毫米）的管子连接到平台上，如图1所示。我们基于最小油间隙和从小内径管子过渡到较大内径管子时可以合并的插头数量，优化平台以在15和100 μLmin-1的流速下运行。我们观察到，对于较高的流速，油间隙较大，适合合并插头。为了解决这个问题，在100 μLmin-1的实验中，通过化学修饰TWEEN20来改变溶液，以减小插头在管子中流动时之间的距离。在100 μLmin-1的流速下，最多可以合并三个插头，而在15 μLmin-1的流速下，最多可以合并8个插头。有关流速选择和样品制备的更多详细信息，请参见图S1和补充信息1 引言、2 材料和方法。同样，将1.5毫米的管子长度调整为组装、混合和存储至少7个最终样品插头，以进行最多14个条件的多重实验。

图1. 多重扩增平台工作流程。步骤1：将各种试剂加载到条带上的孔中，商业设备被编程从每个孔中吸取特定体积的试剂。步骤2：样本合并与储存：从窄管（内径为0.25毫米）过渡到宽管（内径为1.5毫米）可实现样本的合并，并将它们储存在同一管中。步骤3：通过振荡流动混合：一个三通阀连接1.5毫米的管段，一个注射泵被编程以产生振荡流动。步骤4：生成液滴：将样本塞注入微流体芯片以生成液滴。步骤5：为了避免收集由洗塞产生的液滴，芯片出口将自动切换以确保只收集所需的液滴。

在第三步中，合并的塑料塞被混合以获得最终样品塞内均匀的混合物，从而形成均匀的液滴群。通过将三通阀切换连接两个1.5毫米管段，并利用编程注射泵产生振荡分段流（图2a）来实现混合。在这种方法中，在液体塞内形成了两个轴对称的循环区，以增强溶质分子的混合。我们通过分析随后生成的液滴群平均强度变化来研究10微升塑料塞（磷酸盐缓冲液（PBS）和6-羧基荧光素不同比例的合并塑料塞）的混合效率。每种浓度都进行了四次重复实验。我们使用1000个500毫秒循环以1000 μL/min流速对样品进行混合。塑料塞体积影响着其长度和所需混合循环次数：体积越小，混合过程越快。此外，试剂性质如密度、粘度和亲水性也在定义所需混合循环次数方面起着重要作用。图2b展示了利用优化芯片设计生成10微升样品插头所得到的液滴群强度直方图。绿色荧光强度平均变化低于10％，表明在定义好的参数下，在10微升插头内实现了高效混合。完成混合后，样本可用于产生液滴（见图1步骤4；图2c-d）。

图 2. (a) 导管内混合过程示意图。通过编程注射泵产生的脉动流促进了混合。(b) 由混合塞产生的四种不同液滴群的绿色荧光强度的平均变异系数为6.15%，表明混合有效(n=5223)。(c) 来自2 μL样本的液滴的明场图像(标尺=50 μm)。(d) 由优化芯片产生的液滴直径分布，表明产生了单分散群(CV=4.98%，n=562)。

交叉污染的预防和自动液滴收集
在我们的平台中，我们使用单个微流控芯片从多种条件下生成液滴。在通道传输过程中，前一个样本可能会留下试剂残留物，这可能会污染后续样本。因此，必须避免和最小化交叉污染，因为它可能导致不准确的分析结果。为了调查我们平台的交叉污染可能性，我们生成了由红色和绿色荧光染料标记的PBS样品塞组成的两成员液滴库。在散点图中可以看到一些具有中间强度的液滴显示出来自其他染料的污染（见图3a）。在第二项实验中，我们引入了纯PBS清洗塞以清洁微流控芯片之间的样品。这些清洗塞显著减少了交叉污染（见图3b）。然而，在清洗芯片时也会产生一些不需要的液滴。为了避免这些情况发生，我们开发了一个自动液滴收集装置（如图1中步骤5所示）。

图3. (a) 微流控芯片连续生成的两个液滴群的散点图(n=3104)。前一个样本的残留污染会影响后续液滴的生成，导致两种荧光染料的交叉污染。(b) 在每个样本之间插入清洗插头可以减少交叉污染，但中间液滴(云3)仍然会被收集(n=1757)。(c) 使用自动化液滴收集装置收集的两滴液滴库的荧光和明场图像叠加图。(d) 使用自动化液滴收集区域收集的液滴散点图，准确地消除了中间液滴的收集(准确率99.96%，n=2415)。

在液滴生成过程中，该设置利用观察显微镜上的光学计数器，并结合电磁阀（Multiplexer流量矩阵阀, Elveflow）控制微流控芯片的出口。使用这一设置，定制编写的LabVIEW软件根据三个参数在收集和废弃出口之间进行切换：主样本之间的时间间隔、下限和上限计数阈值。工作流速定义了时间间隔。上下限计数阈值确定最初要忽略的液滴数量以及要收集的液滴数量，并且取决于样本体积和每个液滴群的目标大小。

在我们的实验中，我们生成了几个10微升的最终样本胶束，在15微升/分钟的流速下，时间间隔约为75秒。滴液生成后，我们忽略了所有洗胶束的滴液以及每个样本的前2000个滴液。然后，我们收集了每个样本45万至60万个滴液。图3d显示了使用自动化滴液收集方法的两成员滴液库的强度散点图。这一结果表明，自动化滴液收集可以以99.96%的效率成功收集所需的滴液。

液滴编码与解码
在有限的库大小和吞吐量下，之前的应用通常在集成芯片设计中对样本液滴进行时间编码，以便分析序列能够识别不同的实验条件。相反，对于所有我们的微生物学应用中至关重要的离芯片孵育的多重液滴收集，将改变液滴的顺序，使得无法对不同的条件进行分析。因此，有必要实施适当的编码策略，以充分利用高通量液滴微流控技术的全部潜力。为了对多重液滴群体进行编码，使用了四种荧光染料：红色、绿色、远红外和蓝色。对于每种染料，我们选择了两种不同的初始浓度，其中“较高”浓度至少是“较低”浓度的五倍。从装载在液滴采集器孔中的每种浓度的染料溶液中，我们通过与上述描述的其他孔中的染料溶液混合和合并，生成了三个子浓度（0.25X、0.5X、0.75X）的初始染料浓度的10微升小滴。所选浓度经过精心选择，以便在固定的相机曝光时间和光源激发功率下，最终的六种强度值落在检测限范围内，并且在8位或16位图像中可以区分开来。使用四种染料和单一颜色的色调，我们可以创建一个包含24个成员（4种染料X6种浓度）的库。

接下来，我们生成了每两种染料的二元组合在三个亚浓度下的最终样品，每种组合10微升。采用这种方法，并固定样品体积为10微升，可以实现24个和144个（6×24个代码）带有四种染料的二元组合代码。

为了建立解码管道，我们生成并分别收集了每对染料的24种配对组合。在对应的荧光通道中对液滴进行成像（如图4a所示）。使用Python脚本，在每张图像中识别液滴，并测量每个单个液滴的平均强度，以识别不同的液滴群体。图S5显示了每种染料的两个浓度下的强度直方图。为了识别不同的液滴群体，我们使用了基于密度的空间聚类（DBSCAN）。DBSCAN将在每种组合中识别密集区域或簇，并从液滴库中消除噪声（如图4b所示）。在我们的实验中，噪声源是由运输过程中的液滴融合或分裂引起的。这些源会导致液滴偏离簇中心或产生与颜色编码构造不符的混合强度群体。我们可以使用单色强度的二元组合以及一个无荧光染料的群体来获得144种荧光编码。添加单色色盘（图S5）将使编码可能性增加到169个荧光条码。

图4. (a) 包含24种颜色编码的每对组合的荧光图像。为了识别带有条形码的液滴群体，从每种颜色编码组合的原始数据中提取强度信息（每对组合至少包含4078个液滴），并使用DBSCAN进行分析，如图b所示，以2D散点图的形式表示每对库中的颜色编码群体。从核密度估计得出的轮廓表示每个簇的密度分布。

然而，一旦簇之间的距离不同，DBSCAN的可靠性就会降低。例如，在我们的实验中，对于最低的初始染料浓度，簇之间的距离比最高时更近。这需要进行多次DBSCAN迭代，并调整算法参数以每次识别所有簇。此外，如果在某个条件下滴液的数量较少，由于样本量较小，DBSCAN可能会忽略该条件。为了避免在每次实验中进行这些工作并建立一个可靠的分析管道，我们开发了一个机器学习模型。该模型使用DBSCAN聚类结果进行训练，并通过两步识别条件。首先，它识别颜色组合，然后，为每个组合识别颜色编码。为了展示该模型的适用性，我们准备了一个包含24种荧光代码的库，这些代码是通过混合蓝色-远红和绿色-红色组合的滴液生成的（图5a）。使用该模型，可以识别颜色组合，并检测使用的光学代码。图S6显示了该模型在识别组合时的准确率超过99.7%（表S2）的混淆矩阵。在图5b中，使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）算法，将24个成员库中的荧光条形码在二维散点图中可视化。

图5. (a) 一个24个液滴的荧光图像（标尺 = 100 微米）。从蓝色-远红外和绿色-红色组合中各混合了12个代码。基于K近邻分类器的机器学习模型被开发出来，以以99.7%以上的准确率识别组合及其对应的颜色代码。(b) 显示识别出的24个群体（标记为1-24）在库中的二维t-SNE图（n = 3785）。

值得强调的是，169种荧光条码是实验中可供选择的编码空间，但可能会受到需要用于检测的荧光通道的限制。因此，最终的文库大小将由检测要求决定。即使只使用两种编码颜色，也可以构建24-36个成员的文库。四色编码设置允许用户选择对检测测量干扰最小的颜色。

除了编码空间外，构建目标库所需的时间也是一个关键因素，它由操作流速和库制备所需的试剂数量决定。在我们的实验中，我们使用了15 μL/min的操作流速。在该流速下，我们可以合并多达八种试剂，这使得12个条件（见图1步骤1-5）的操作时间约为一小时。然而，如果需要较少的试剂，我们可以使用更快的流速，从而降低准备时间。表S1显示了使用不同流速制备12个多重样本所需的时间（根据可用试剂的范围）。我们还计算了在不同流速下可以在2小时内制备的最大滴液库大小，以概述该技术在使用微生物接种物（即样品制备应比微生物生长的滞后期快）的实验中的容量。范围在15 μL/min时为27个条件到100 μL/min时为42个条件之间。此外，如果需要，可以不使用对生物/化学样品有严格时效性的多重滴液群落。生物/化学样本可以通过高频率（1kHz）的微注射技术引入到每个液滴中。此外，所提出的编码策略使液滴库能够与各种分析技术集成，例如荧光激活液滴分选、质谱、荧光显微镜和光学光谱方法。

抗生素敏感性试验
为验证多重检测平台的适用性，我们对大肠杆菌JW992菌株进行了抗生素敏感性试验，测试了四种抗生素。该菌株在我们之前的研究中已经被广泛研究其对抗生素的敏感性。我们选择了四种抗生素：盐酸四环素（TET）、盐酸环丙沙星（CIP）、硫酸卡那霉素（KAN）和奈替米星（NA），并知道这种大肠杆菌在测试范围内对其中两种化合物（TET和CIP）具有敏感性。我们通过两次运行制备了一个包含25个10微升插件的库（总组装时间约2小时）。

使用该平台，将细菌细胞与每种抗生素的六个浓度混合，从一个初始浓度开始。此外，还制备了一个不含抗生素的对照群体。在监督下生成液滴后，对液滴库进行8小时动态培养，并对部分液滴进行成像以进行生长分析和解码。

利用分析管道，我们可以自动识别颜色代码（如图6c-d所示）。因此，我们对每个菌落中每个滴液的生长情况进行了分析。控制菌落的生长分析散点图显示有两个独立的菌落群：空的和具有生长能力的滴液。利用这一信息，我们在其他菌落的生长分析值上设置了一个阈值（=15，见支持信息部分7），以识别具有生长能力的滴液。然后，我们引入了生长分数的概念，即考虑滴液占用情况的菌落平均生长情况（见支持信息部分7）。图7a-d显示了每个抗生素的正常化生长分数的直方图。

图6. 设计了一种针对大肠杆菌的抗生素敏感性检测实验，以研究该平台在微生物学应用中的适用性。图6(a)展示了在培养后用于生长量化的明场图像。图6(b)展示了三个示例性液滴的原始图像（上）及其经过图像处理步骤后的最终二值图像（下）。通过测量白色像素的面积并对其进行归一化以获得液滴面积，可以对生长进行量化。图6(c)展示了在实验中用于颜色编码识别的四个荧光通道的合并图像。使用机器学习模型，识别出25种颜色代码，并以t-SNE图的形式展示了一个生物重复样本（n=7533个液滴）的结果（图6d）。

图7. 通过分析管道对不同颜色编码的每个液滴内的生长情况进行了量化。为了解决在大型库群中（在复制1中为近100万个液滴中的7533个或14,084个，在复制2中为近100万个液滴中的7533个或14,084个）对小样本量的分析，引入了生长分数以对每个条件的效果进行归一化。(a)、(b)、(c)和(d)分别显示了对两种生物复制中不同浓度的萘啶酸、卡那霉素、四环素和环丙沙星的细菌培养的正常化生长分数的条形图。(e)和(f)分别显示了两种生物复制中环丙沙星和四环素的对数拟合结果。对于每种抗生素，将曲线的95%减幅视为其最小抑菌浓度，分别为0.11和1.01微克/毫升。误差条表示平均值的标准误差。

我们将能够使细菌生长率降低95%以上的抗生素定义为“敏感”抗生素。在比较最高抗生素浓度与对照组时，这种分类对于MIC计算是必要的，因为MIC仅适用于敏感抗生素。接下来，我们对标准化生长分数条形图进行分析，以确定MIC。通过拟合非线性剂量-反应曲线，我们确定了TET和CIP的MIC分别为1.01和0.11 μg/mL（如图7e-f），MIC标准设为使拟合曲线生长分数降低95%。MIC值落在传统微量滴定板实验确定的MIC质量范围（2倍稀释范围从MIC）内（如图2和附录A补充材料所示，CIP为0.0625 μg/mL，TET为0.0125 μg/mL），这验证了该确定MIC的方法的有效性。

研究表明，根据抗生素的理化性质、浓度和液滴间距，抗生素可能会在液滴之间泄漏。因此，有必要事先确定所有抗生素的特性，并在实验中采用适当的控制条件，以确保精确的实验结果。对于我们的菌株，在对照组中未观察到抑制作用，MIC结果可靠。对于本实验，我们认为可能的泄漏效应无关紧要，但对于每项操作，验证这一点至关重要。该研究报告强调了该平台从多重实验条件到分析复杂数据集的能力，这对于高级微生物学实验具有深远的意义。

结论
我们提供了一种自动化的按需多重样本制备平台。使用该平台，可以从2至10微升的样本插孔体积中实现无交叉污染的单分散皮克级液滴库。我们开发了一个灵活的编码空间，其中包含多达169个光学条码，可用于同时研究滴液式微流体学中的不同实验条件。我们还开发了一个稳健的解码机器学习模型，可以有效地识别液滴库中的颜色代码。此外，我们成功地展示了该平台可以执行抗生素耐药性检测并确定大肠杆菌的MIC浓度。

在我们的实验中，显微镜是测量液滴含量的方法。这意味着我们只从液滴库中抽取一小部分样本来评估实验条件。然而，我们还开发了一种光学流体测量技术，可以在高速流动（高达1 kHz）的情况下分析液滴含量。将该平台集成到该技术中将通过提高分析通量显著提高分析精度。然而，对于许多条件的数据分析，尤其是在结合明场图像分析生长时，仍然具有挑战性，并且只能以较慢的速度进行。在我们未来的工作中，我们计划将平台与光学流体测量集成，并实现实时数据分析。此外，在改善液滴生成时间通量方面，可以根据微生物需求使用多个Mitos单元或更小的终端插件。此外，还可以增加管道长度以最大化存储和混合插件数量。

我们设想通过将各种实验条件整合到液滴培养实验中, 该平台将成为微生物应用领域重要途径, 包括组合药物发现、抗生素耐药性研究、试剂优化和新型天然产物筛选等方面. 例如, 可以同时评估自然环境中微生物群落在不同条件下(如培养基) 的生长情况, 并可选择并筛选出含有新型天然产物的特定微生物群落. 此外, 代谢组学方法使得对这些群落功能潜力进行了解变得可能. 因此, 该平台增强了对微生物世界功能多样性理解能力.


参考文献：
Samimi, Ashkan, Sundar Hengoju and M. A. Rosenbaum. “Combinatorial sample preparation platform for droplet-based applications in microbiology.” Sensors and Actuators B: Chemical, 2024 (417): 136162. https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136162

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