工程化类器官（Engineering Organoids）

2024-08-0153

可靠创新同行发展

类器官是在体外微型化和简化的组织模型系统，因其在模拟组织发育和疾病、个性化医学、药物筛选和细胞疗法方面的巨大潜力而备受关注。尽管在培养生理学相关的类器官方面取得了显著进展，但仍存在一些挑战，阻碍了其在现实生活中的应用。特别是，自组织生长的高变异性以及有限的实验和分析访问限制了类器官系统的可移植性。在这篇综述中，我们提出，通过在类器官系统各个层面上采用工程学方法，可以解决传统类器官培养中的许多限制。我们研究了细胞表面和基因工程方法，并讨论了基于设计基质以实现对类器官生长和形状的时空控制的干细胞微环境工程。我们探讨了微流体方法和从器官芯片中学到的经验如何使机械生理参数的整合成为可能，并提高了类器官的可访问性，以改善功能读数。将工程原理应用于类器官可以提高可重复性和提供实验控制，这最终将有助于实现类器官在临床上的应用。

我们对干细胞行为的理解取得了重大进展，导致建立了复杂的三维培养系统，被称为类器官（organoids）（详见框1）。事实上，给予干细胞一组生化和生物物理信号，模拟体内干细胞微环境，使其能够保持分化成其来源组织中不同类型的细胞，并在体外培养时不断自我更新以补充干细胞库。在这些人工条件下，干细胞不仅可以增殖，还能够自我组装成复杂结构。与传统的二维培养系统相比，三维器官样体更接近天然器官，在基因和蛋白质表达、代谢功能和微观组织结构方面表现更好。因此，类似于已经建立起来的器官芯片系统（详见框2），器官样体提供了一个有前景的工具用于推动个性化医学和下一代药物筛选，并且减少对动物实验的需求。越来越多种类的器官都可以建立相应的样体模型，包括但不限于肠道、胃、肾脏、肝脏、胰腺、乳腺、前列腺以及上呼吸道等等；这些模型可以由组织固有成年干细胞(ASCs)直接从活检样本中获取 (图1)，或者由多潜能干细胞(PSCs)，如胚胎干细胞(ESCs)或诱导多潜能干细胞(iPSCs)(图2)，通过重新编程分化的组状类型而得到。

图1: 组织来源的类器官。

类器官可以从各种器官的组织样本中生成。A1AT， α -1抗胰蛋白酶;IBD，炎症性肠病;SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。

图2: 多能干细胞衍生的类器官

类器官可以由多能干细胞生成，用于多种器官。AD，阿尔茨海默病;ALI，气液界面;ASD，自闭症谱系障碍;DKC，先天性角化不良;肠内内分泌失调;EB，胚状体;胚胎干细胞;诱导多能干细胞;LCA, Leber先天性黑朦;PD，帕金森病;多囊肾病;RP，视网膜色素变性;呼吸道合胞病毒;寨卡病毒。

在标准的ASC衍生类器官培养系统中，单个干细胞(或小细胞簇)被植入基质中，该基质模拟细胞通常所处生态位的基本方面。在针对关键调控途径的适当信号条件下，细胞经历增殖、分化、迁移和选择，尽管缺乏空间组织的线索，但它们生长成可以经历对称破缺的结构，并获得显著程度的结构复杂性，在一定程度上反映了其体内器官的组织和细胞类型多样性。ASC衍生的肠道类器官通常首先生长成单层球体，形成隐窝样突起，使人想起原生组织的腺上皮。在体内，隐窝和绒毛沿轴方向形成图案需要形态发生梯度;值得注意的是，肠道类器官在均匀的培养条件下(即没有任何确定的外部梯度)获得了类似的细胞类型组织。类器官在与相应器官的结构相似性和功能再现方面进一步超越了二维细胞培养。例如，肠道类器官可以产生粘液，吸收和分泌生物分子，并表现出上皮屏障的完整性。由于干细胞的维持，asc衍生的类器官似乎可以无限扩展，使它们成为不可思议的未转化原代细胞的宝贵来源。

PSC衍生的类器官是很有前途的平台，用于模拟器官，如大脑，其中组织样本不容易获得，并用于模拟器官发生的发育过程。与体内器官的发育类似，PSCs生长、分化并最终形成结构和功能与成人器官相似的类器官。例如，生成脑类器官的方案通常从PSC的聚集体开始，这些聚集体形成所谓的胚状体。在第一个悬浮培养步骤之后，这些胚状体被嵌入细胞外基质(ECM)-富含蛋白质的基质中，并放置在旋转的生物反应器中，它们在其中生长成具有与各种脑区域相对应的室室的自组织神经上皮结构。然而，这种发展依赖于分化过程的随机性，这最终导致了类器官之间的高度异质性。为了更好地控制分化过程，开发了几种方案，目的是产生特定大脑区域的类器官;例如，类似大脑皮层、小脑或中脑的脑类器官。此外，中脑类器官的产生也已经从分化程度更高的神经上皮前体细胞开始，这最终导致了功能更强的类器官。

内胚层来源的上皮类器官，如胃肠道和呼吸类器官，也可以由PSCs生成。PSCs可以分化为内胚层祖细胞，然后嵌入富含ECM蛋白的基质中，在适当的刺激下成熟，形成与天然器官相似的结构。与ASC衍生的类似物相比，它们也含有间充质层，通常更大，但是，一旦建立，它们不容易通过简单的传代进行繁殖。

类器官已被证明在基础研究中的许多应用中是有用的，并为生物医学的进步做出了贡献(图1、2和框3)。然而，类器官尚未广泛用于转化研究，如药物筛选或再生医学。类器官被广泛建议通过使用健康细胞来替代患病组织，从而增强医学移植的能力，事实上，在小鼠身上进行的几项研究证实了这一希望;然而，通往实际应用的道路是漫长的，为了充分利用类器官的潜力，必须克服几个限制。

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专栏1 类器官系统的历史

第一个体外器官模型是以癌细胞为基础的，因为癌细胞是不朽的，很容易维持。然而，由于对癌前基因突变的积极选择，癌细胞系的分子特征发生了高度改变。因此，中枢通路，包括细胞周期调节基因、生长因子、受体、肿瘤抑制因子和致癌基因，都是失调的。此外，癌细胞系不能从每个患者样本中建立，因此，它们不能代表人群中的遗传变异。此外，这些模型是在二维中培养的，因此缺乏空间组织，无法概括出一整套健康分化的细胞类型。另外，原代外植细胞可用于体外模拟哺乳动物组织。这些培养概括了细胞异质性，因此在生理学上更相关。然而，它们缺乏自我更新的能力，而且它们的培养依赖于新鲜的手术组织，这限制了它们的适用性。

1975年，James Rheinwald和Howard Green开创了类器官的研究领域，他们发现人原代角质细胞和受辐照的小鼠成纤维细胞共同培养可形成层状自组织鳞状上皮，细胞分裂局限于基底层，上层存在终末分化的角质化细胞，类似于层状皮肤。这项工作是第一次对未转化的人类细胞进行长期培养。1987年，Mina Bissel小组首次强调了在三维水凝胶中培养细胞的重要性，他们证明了在细胞外基质样环境中，原代乳腺上皮细胞向泡状结构的功能分化和病理状态的再现，开创了体外形态发生领域。

成体干细胞可以在体内产生组织的所有细胞类型，并且它们不断自我更新以补充干细胞库。在2009年发表的一项具有里程碑意义的研究中，Hans Clevers实验室报道了将单个肠道干细胞植入具有组织样硬度和必需可溶性生态位因子的细胞外基质替代物中。干细胞增殖并形成复杂的三维组织结构，包含干细胞和各种分化细胞类型，现在被认为是第一个类器官。这些肠道和其他上皮类器官，如胃或肝类器官，自组织成部分类似于原始组织的结构。这些类器官中的干细胞群得以维持，使它们成为未转化细胞的宝贵来源。上皮类器官本质上是囊性的，即它们由围绕中心管腔的封闭结构的单层细胞组成，这使得实验进入具有挑战性，并且重新播种的必要性阻碍了长期研究。

由人类多能干细胞(PSCs)发展而来的类器官，对于无法获得细胞的工程组织(如大脑或视网膜)尤其有用。PSC衍生的类器官是由Yoshiki Sasai小组首创的，他们通过模拟发育途径，在体外从胚胎干细胞中形成皮质组织和光学杯状结构。成体干细胞衍生和PSC衍生的类器官依赖于干细胞及其后代的内在能力来自组织和形成三维结构，类似于体内组织，这使它们成为药物筛选和疾病建模的有前途的模型系统。

框2 类器官和器官芯片

芯片上的器官是模拟人体器官的类器官的替代(但补充)方法。类器官依赖于生长的细胞聚集体的自组织，而芯片上的器官则基于还原论的工程方法。器官芯片旨在通过模拟在体内执行这些功能的组织元素来捕获特定器官生理功能不可或缺的关键功能。因此，芯片上的器官通常包含特定的细胞类型以及体内微环境的关键生化和生物物理特性。器官芯片领域的里程碑是由donggeun Huh等人建立的肺芯片器件，该器件随后被进一步用于模拟其他器官，如肠道和肾脏。这些器件易于读出，并允许精确控制环境参数。此外，芯片上的器官通常是可复制的，与类器官系统相比，它们的寿命更长。然而，它们往往缺乏组织的复杂细胞结构。此外，器官芯片平台需要复杂的实验装置，包括管道、泵和对微加工设备和专业知识的要求。最后，与类器官相比，细胞系的使用降低了芯片上器官的生理相关性。

专栏3 类器官的应用

类器官广泛用于模拟和研究组织发育、体内平衡和再生，例如，确定干细胞分化为特定谱系所需的因素或细胞命运程序背后的分子机制。类器官还使必要基因的敲除研究成为可能，由于胚胎致命性，这在体内是不可行的。多能干细胞(PSC)衍生的类器官是一个非常宝贵的发育生物学模型系统;例如，通过在单细胞水平上分析人类和非人类灵长类动物的脑类器官，发现了神经发育过程中人类特有的特征。

在小鼠中建立疾病模型与技术和伦理挑战有关，并且小鼠细胞往往不能概括人类病理的所有方面。或者，人类类器官也可以应用;例如，促癌基因可以在胃肠道类器官、肝脏类器官、胰腺类器官或乳腺类器官中发生突变，以研究癌症中获得性突变与生长因子依赖性之间的关系。对于许多神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和自闭症谱系障碍，缺乏准确的动物模型。脑类器官是研究这些神经系统疾病中涉及的细胞和分子过程的一个有价值的模型;例如，在类器官样3D培养系统中，疾病特异性突变形式β-淀粉样前体蛋白和早老素-1的过表达允许AD的表型重现，并揭示糖原合成酶激酶3 (GSK-3)的含义。同样，在富含亮氨酸重复激酶2 (LRRK2)的基因编码中引入突变，可以从中脑类器官产生PD模型，这概括了PD的关键病理特征。该模型带来了新的机制见解，例如硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)参与LRRK2突变依赖性多巴胺能神经元死亡。

类器官也可以从患者的细胞中生成。例如，来自囊性纤维化患者的肠道类器官显示出异常的氯离子通道功能，可以通过纠正致病突变来挽救。类似地，来自炎症性肠病(IBD)患者的类器官捕获疾病的病理生理方面，并提供转录和甲基化改变的信息。个体患者的疾病表型也可以使用诱导PSC (iPSC)衍生的类器官进行研究;例如，脑类器官已经从小头症患者或自闭症谱系障碍患者的iPSCs中产生。值得注意的是，在AD患者ipsc衍生的脑类器官中，在tau过度磷酸化之前观察到淀粉样蛋白病理，这揭示了AD表型的争议。患者特异性ipsc衍生的视网膜类器官允许建模视网膜色素变性和Leber先天性黑朦，有助于建立有效的基因编辑疗法所需的知识。多囊肾病患者的肾类器官与健康对照的类器官相比，囊肿形成显著增加，从而发现微环境在多囊肾病中的关键作用。事实上，在iPSC类器官中也重现了许多其他病理。

癌症类器官可以从肿瘤活检样本中获得，包括胃肠道样本，肝脏样本，乳房样本，前列腺样本和肺部样本。癌症类器官捕捉到疾病的异质性，因此，为个性化医疗预测临床治疗结果提供了一个极好的工具。它们还允许中通量到高通量的治疗筛选和药物毒性评估。

类器官也是感染生物学中有用的模型;例如，上皮类器官可用于研究宿主与微生物的相互作用。胃类器官用于研究幽门螺杆菌感染，脑类器官用于模拟和研究寨卡病毒感染机制。类器官是应对SARS-CoV-2大流行的另一个有价值的研究工具。肺、毛细血管、肾脏和肠道类器官可能被病毒感染，这为了解组织趋向性和复制位点提供了线索。

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当前类器官系统的局限性
有限的成熟度和功能

在肠道(粘液产生和吸收活动)、胃(组胺诱导的酸化)、肝脏(白蛋白表达、糖原积累和低密度脂蛋白摄取)和乳腺类器官(产奶)中已经实现了令人印象深刻的生理功能;然而，没有一个已建立的类器官系统能够复制其各自器官的全部功能。类器官通常缺乏关键的特化细胞类型，由于(部分)缺乏间质室、血管化和/或微生物组，不能再现天然器官的复杂性。尽管已经建立了多室类器官，但它们缺乏一致的细胞组织，这阻碍了忠实和可靠的实验读数。流动、空气界面或机械刺激的应用可以改善体外细胞的终末成熟;然而，这些功能的集成在技术上仍然具有挑战性。类器官系统的一个重要缺点是它们在培养中维持的时间有限。上皮类器官的寿命约为一周，这通常不足以在体内将ASCs稳健地分化为预期的全套分化细胞类型。这种培养时间限制在psc衍生的类器官中甚至更成问题，它们的寿命与体内器官发生的时间存在巨大差异，特别是在人体系统中。因此，这些类器官通常不能成熟到超过胎儿表型。因此，脑类器官，例如，正在模仿胎儿大脑表型，需要进一步努力加强成熟，以获得一个忠实的成人大脑模型。

可获得性

类器官的有限寿命往往是限制可及性的直接后果。随着类器官的增长，依赖扩散的营养供应和废物清除变得不那么有效。例如，在囊性上皮类器官中，死细胞积聚在空心腔中，因此，类器官必须破碎并重新播种。大脑类器官可以长到几毫米大小，缺乏营养会导致内核坏死，这只能通过摇动培养物来部分解决。除了营养供应的问题外，难以接近也给控制类器官的不同区室带来了问题。在上皮类器官中，如肠类器官，实验通常需要进入上皮的内外部。例如，在关注宿主-病原体相互作用的研究中，微生物需要被输送到类器官的顶端(通常面向管腔)，而代谢物和细胞因子则优先从基侧输送。

非均质性

类器官系统在类器官形成效率、终点形态和功能方面也存在相当大的可变性，这往往是体外自组织和细胞命运选择的随机性所固有的。减少这种可变性对于充分利用类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学中的潜力至关重要。需要进一步探索工程策略，如提高自动化程度，使用定义的介质和基质，以及精确的现场评估，以减少类器官发育的可变性。此外，类器官生长的初始条件有助于类器官变异性，包括起始细胞群，它们的定位和聚集。自动化的一个关键限制也是类器官生成方案的复杂性，这通常需要多个实验步骤，特别是对于psc衍生的类器官。例如，简化生成背前脑类器官的程序大大提高了可重复性。工程技术——从工程细胞到整个生物体工程——有望增加类器官方案的稳健性。

读出（Readouts）

常规使用的装置主要使用光学监测作为读数，它只能提供关于类器官功能的很少信息。代谢物、分泌肽或电位的原位监测受到与类器官形成相关的变异性的挑战。例如，测量跨上皮电阻为二维跨上皮培养系统评估上皮屏障完整性提供了一种标准技术;然而，在类器官中进行此类测量在技术上具有挑战性。同样，肝脏体外系统的功能可以通过分析外源性化合物和内源性底物的代谢物，或胆汁和蛋白质(如白蛋白或转铁蛋白)的合成来评估。然而，只有少量的这些分析物通常存在于单个类器官中，这使得它们的分析变得困难。将微型生物传感器集成到类器官系统中可以解决这个问题，这需要对培养设置进行调整。事实上，包含许多类器官的典型水凝胶圆顶对于结合生物传感器电极是相当不切实际的。分析物的一致测量将需要能够控制类器官位置和限制类器官形状的设置。此外，与药物筛选应用相关的高通量测量需要实现自动化功能测量。

这些问题限制了类器官的可翻译性，这是它们的设计原则所固有的。因此，仅仅微调可控参数(例如，细胞因子和基质组成的选择)可能不足以克服这些限制。类器官系统的设计需要重新评估，以增加可控参数的数量。通常通过对芯片上器官技术的概念验证研究来探索的工程方法，为解决类器官平台的许多局限性提供了可能性。在这篇综述中，我们讨论了不同尺度的工程策略，包括(亚)细胞行为工程、局部(生态位)组织工程和创建整个生物体整体模型的工程尝试。最后，我们研究了读出类器官功能发展的新方法，以便更彻底地表征和纳入高通量分析管道(图3)。

图3: 类器官的工程方法

工程方法可以在几个层面上应用于类器官，包括细胞水平、生态位水平、多组织水平，并改善功能读数。

设计细胞

细胞作为类器官的组成部分，是一个很有前途的操控点。事实上，改变细胞的内在特性提供了一个强大的方法来增加类器官的健壮性，并为特定的应用量身定制它们。

表面工程

较差的生长稳健性和模式是类器官的主要限制，导致高度异质性的终点集合。实际上，初始培养条件决定了细胞(或细胞簇)是否会通过自组织形成类器官。特别是，初始细胞聚集体的大小和形状是重要的起始条件，由于初始细胞数量的微小偏差，许多方案失败。控制细胞聚集通常是通过微孔结构或微流体装置来实现的;或者，可以修饰细胞表面，即细胞膜，以改善或启动细胞聚集。例如，细胞膜可以用特定的附着肽、蛋白质、纳米颗粒、聚合物或生物正交化学物质来修饰，通常是通过生物正交化学连接(例如，使用n -羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、唾液酸、氧胺及其衍生物)、静电相互作用或脂质体递送。功能化细胞表面(即细胞上的酮或氧胺基团相互结合)之间的生物正交肟形成反应随后导致多层微组织(例如，人间充质干细胞和成纤维细胞)的形成，其大小和密度受光介导控制。合成DNA片段与细胞表面的结合也得到了广泛的探索;例如，用3D DNA折纸纳米结构装饰细胞表面可以实现细胞-细胞粘附的编程。另一种在体外控制细胞空间排列的优雅方法是对被膜结合纳米颗粒磁化的细胞施加外部磁场。我们建议，这种表面工程方法也可以应用于类器官领域，以预先组织不同的起始细胞类型，例如，将内皮细胞排列在更大的肝细胞簇中，这将允许产生更生理相关和更长寿的血管化肝类器官。

基因工程

除了修饰细胞表面，大量的基因工程策略可用于控制细胞的内在特性。在遗传水平上，细胞可以通过两种概念上不同的方式进行工程改造:通过靶向控制干细胞分化和/或关键生态位信号的通路成分，或者通过集成受合成生物学启发的人工逻辑电路。类器官系统通常缺乏终末分化的细胞类型，这与我们对干细胞命运驱动因素的理解有限，以及在体外外源的、广泛应用的信号对体内线索的再现较差有关。例如，通过CRISPR-Cas9技术进行的靶向基因组编辑已经证明了其在基础研究和临床应用方面的巨大潜力，尽管仍然存在对脱靶效应的担忧。

基因组编辑可以用来修改类器官中细胞对外部刺激的内在反应，目的是产生原本不存在的细胞类型。此外，特定分化驱动因子的诱导表达可以用于促进细胞的终端分化，否则可能只存在于更不成熟的状态。例如，细胞色素P450超家族蛋白(CYP3A4)的靶向转录激活可促进PSC衍生的肝类器官的细胞成熟。相反，基因工程可以用于敲除特定细胞亚群中的相关信号通路，使它们对相应的刺激没有反应，这可以解决类器官中缺乏空间信号控制的问题。然而，这种有针对性的方法需要了解细胞命运决定背后的调控网络，而这些知识通常仍然有限。此外，基因编辑技术是复杂的，基因工程类器官本质上不太具有生理相关性，这对于细胞-细胞相互作用和自组织过程的研究尤其不可取。

基因编辑也可以以纠正范式进行，即纠正单个致病突变。例如，基因校正的患者来源类器官可以为自体移植补充病变组织提供来源。类器官的基因校正首先在囊性纤维化患者的肠道类器官上进行。在这里，通过CRISPR-Cas9纠正了CFTR基因中的因果突变，并在福斯克林诱导的肿胀试验中评估了由此产生的类器官的功能恢复。视网膜类器官来源于色素性视网膜炎患者的iPSCs，也可以通过基因校正来修复光感受器形态和功能缺陷。尽管这些经过基因校正的类器官没有被移植到动物模型中，但它们展示了将基因编辑技术应用于临床移植的潜力。此外，在逆向方法中，可以在健康的类器官中设计特定疾病，目的是发现突变对疾病的因果关系并模拟特定的病理方面。例如，在健康的结肠直肠类器官中连续诱导单一基因突变可以模拟癌症表型。有趣的是，诱导突变的数量与异种移植的致瘤能力相关。此外，腺瘤性大肠息肉病和p53的缺失足以诱导染色体不稳定和非整倍体，这两者都是癌症的标志。类似的实验可以在体外建立各种相关的疾病模型，并突出或确定特定基因对先天性或获得性病理的因果影响。这样的实验在二维细胞培养中不具有生理学或病理学相关性，因为效果可能依赖于缺失的细胞类型，类似的动物研究与技术和伦理挑战有关。

基因组编辑技术不仅可以针对单个基因，还可以整合整个人工遗传回路。特别是，合成生物学使这种基因回路的工程能够通过反馈回路产生多细胞逻辑反应和自组织。人工基因电路的整合也将有利于类器官领域，尽管这样的研究尚未进行。尽管如此，合成生物学方法已被用于简化细胞系统中的细胞聚集编程。受哺乳动物胚胎发育过程的启发，简单的图案形成可以使用图灵反应扩散系统来设计，该系统由两个扩散配体Nodal和Lefty组成。由于它们的相互激活和抑制，在其他同质细胞群中可以形成特征性的点样模式。此外，基因工程刺激有可能偏向细胞命运的选择;例如，转录因子GATA6表达的脉冲足以启动iPSCs均质集群中的胚层出现和对称性破坏。

遗传电路也可以与细胞命运选择相结合，例如，在基于notch的工程系统synNotch中。在该系统中，Notch受体的细胞外结构域被改变以识别用户定义的配体，从而允许对细胞正常Notch信号转导级联的输入进行实验控制。至关重要的是，synNotch受体的胞内结构域也可以被设计为激活亚细胞信号因子。输入和输出可以被控制，例如，用于纤维母细胞到成肌细胞转分化的接触依赖转录触发。在多组细胞中，synNotch系统也被整合到基于cadherin的细胞-细胞粘附控制回路中(图4)。一组细胞表达CD19表面配体，第二组细胞表达synNotch受体，以响应CD19(即第一组)，触发E-cadherin表达。E-cadherin表达的增加导致细胞聚集，这是由于相互结合亲和力的增加。有趣的是，通过在第一个细胞群中引入第二个synNotch受体，两个细胞群之间的串扰导致了自分类。聚集的第二种群激活第一种群的相邻细胞，表达低浓度的e -钙粘蛋白以及其他基因(即荧光报告基因)。由于细胞-细胞结合的亲和力不同，形成了具有自主对称性破缺和细胞类型分化的三层自组织结构。该系统还能够在扰动下再生模式，完美地说明了在多细胞环境下人工基因网络的整合，并强调了基本的形态发生可以由纯粹的合成生物学方法触发。

图4: 引导形态发生的工程细胞

当混合在一起时，两种基因工程细胞自组织成多层组织。显微镜图像显示，A型细胞(蓝色，BFP+)和B型细胞(灰色)混合在一起，通过相互激活和抑制E-cadherin (E-cad)的表达，它们与A型细胞、C型细胞(绿色，GFP+)和D型细胞(粉红色，mCherry+)发育成三层结构。首先，在a型细胞存在的情况下，b型细胞转化为c型细胞，由于其高E-cad表达而自我聚集。这些细胞在其表面呈现GFP，反过来，通过激活其合成的抗GFP受体，导致邻近的a型细胞表达低水平的E-cad和mCherry蛋白，这将导致它们转化为d型细胞。BFP:蓝色荧光蛋白;绿色荧光蛋白。

细胞内在特性的工程设计肯定会在类器官领域获得更多的牵引力，不仅用于基础研究，而且还可以作为精确控制细胞命运的多功能工具箱，甚至可能用于定制形态发生。此外，结合先进技术，如光遗传学，将有可能扩大逻辑电路的可定制性及其在类器官中的应用，允许精确的时空控制。

潜在市场

自从第一个ASC衍生的类器官建立以来，很明显，干细胞生态位的模拟是干细胞在培养中成功自组织生长的关键。干细胞生态位的许多特征，包括ECM、邻近细胞和它们分泌的信号分子，已经被重述;然而，这种各向同性的刺激还不足以培养出与生物医学应用中的体内器官高度相似的类器官。事实上，类器官培养条件受到有限的细胞反应性和批间可变性的影响。因此，工程仿生平台提供了更忠实的体内生态位代理，可以改善对细胞生长和分化的控制，从而导致更适合临床翻译的生理相关模型系统。

设计矩阵

干细胞生态位中的ECM是干细胞自我更新和分化的重要参数，而ECM组成的改变是许多疾病的标志。因此，ECM是几乎所有类器官培养系统的基础。Matrigel(或类似的市买产品，如Geltrex)是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的富含层粘胶蛋白的基底膜，是类器官最常用的基质，在体外为类器官提供一套复杂的ECM信号输入和适当的机械环境。然而，Matrigel并没有很好地定义(这并不奇怪，考虑到它是由近2000种独特的蛋白质组成的)，并且提供有限的定制可能性，阻碍了将其纳入定制的基于类器官的检测。此外，Matrigel是动物源性的，这阻碍了转化为临床环境。因此，为了克服这些问题，人们一直在努力生产明确的水凝胶，遵循两种一般策略:由天然存在的材料例如纤维蛋白、胶原蛋白或透明质酸生成的基质以及合成水凝胶。

与动物来源的基质相比，基于蛋白质或多糖的生物聚合物可以重组生产，减少了伦理问题和批次间的可变性。或者，具有合成骨架的水凝胶可以用广泛的生物活性分子修饰，包括ECM分子或ECM片段。例如，与基膜蛋白层粘连蛋白功能化的聚乙二醇(PEG)基水凝胶能够实现可再生的肠道类器官形成。在这些化学定义的水凝胶中，肠道类器官的产生依赖于基质降解提供的凝胶随着时间的推移逐渐软化。完全合成的生长基质可以通过与ECM蛋白的短关键氨基酸序列相匹配的肽而不是全长蛋白进行功能化，例如与纤维连接蛋白基序RGD、胶原基序GFOGER和层粘连蛋白基序IKVAV相对应的肽。这种基质在支持单个肠道干细胞形成肠道类器官方面取得了一定的成功，然而，它们仍然不如含有全长层粘连蛋白的基质。然而，PSC衍生的肠道类器官在这种合成基质中的生存能力与Matrigel中的生存能力相当。

合成基质还提供了实验解耦类器官生长环境的刚度、可变性和生物活性的机会，为研究每个参数对干细胞命运的影响开辟了筛选方法的可能性。此外，合成基质可以设计用于特定的类器官应用。事实上，除了更明显的生物学特征外，物理特性应该被考虑用于3D细胞培养的新基质工程。硬度是影响干细胞行为的关键生态位参数，似乎是间充质干细胞向不同谱系分化的关键决定因素。因此，用于类器官培养的工程基质应该考虑这些物理因素，包括刚度、基质粘弹性和可降解性，这些因素必须针对每个特定的类器官系统进行优化。原生ECM是高度动态的、应力松弛的基质，其特性可以在化学定义的水凝胶中进行工程设计。特别是，基质的应力松弛曲线与它们的粘弹性和粘塑性性能直接相关，最终决定了生长细胞结构(如类器官)的机械约束。为了生成具有定制弛豫特性的生物材料，可以应用动态聚合物化学，允许共价和弱可逆交联共存。这种机械精密的生物材料已经在3D细胞培养系统中显示出令人兴奋的结果。例如，间充质干细胞在可调三维海藻酸盐水凝胶中的命运被证明高度依赖于基质的应力松弛，而与初始弹性模量、细胞粘附配体密度和降解无关。

Shape-guided形态发生

在体内器官的发育和稳态过程中，物理边界对细胞和组织的组织起着关键作用。为了在体外提供人工物理边界等几何线索，可以使用微制造、3D打印和激光切割等技术。例如，乳腺上皮细胞可以在具有预定义形状的胶原水凝胶中生长，以概括乳腺上皮小管的分支过程。分支和形成新小管的概率取决于上皮单层诱导的局部几何形状。这一过程是由一种自分泌抑制形态原的扩散所介导的。在肠道类器官中，隐窝样结构的形成是一个高度随机的过程，其方向是随机的，数量是可变的。微工程支架允许肠道类器官以预先定义的方式进行强大的模式。例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)图章可以用来制作胶原蛋白支架的图案，然后将类器官来源的细胞植入支架上。结合应用类似于在体内观察到的形态发生梯度，可以生成与模板的隐窝绒毛结构相匹配的上皮，并具有相应的增殖和分化区域。或者，可以应用激光形状的基质将肠道类器官培养成预定的形状，允许顶端和基部进入，隐窝绒毛样图案，最重要的是，长期内稳态(图5)。在这种情况下，类器官被塑造成可进入的管状结构，随着时间的推移，可以去除顶部脱落的死细胞。这些“微型肠道”的寿命进一步允许罕见的特化细胞类型的发展，这在短命的类器官中是不存在的。有趣的是，即使在没有外部施加的生化梯度的情况下，观察到的与隐窝和绒毛区域相似的细胞模式也得以建立，这突出了支架几何形状的形态形成指导潜力。

图5: 类器官工程的优势

肠道类器官生长在有图案的管状基质中，组织成类似于类器官的隐窝状结构，遵循预定义的结构。干细胞和祖细胞(粉色，Sox9+)以及Paneth细胞(浅粉色，溶菌酶+)存在于隐窝结构中，而肠细胞(黄色，L-FABP+)则存在于管腔中。集成到微流控装置中允许长时间的生长。脂肪酸结合蛋白。

与强迫类器官形成最终形状不同，支架也可用于引导PSC衍生类器官在其发育期间(即胚状体阶段)的形状。例如，在化学定义的微丝支架中生长的类器官采用拉长的形状，这导致神经外胚层的可再生产生，最终，与由球形聚集物产生的标准类器官相比，皮质发育得到改善。将生长中的脑类器官限制在一个薄的圆盘形状，可以研究驱动脑褶皱形成的生物物理力量。有趣的是，通过使用LIS1突变的细胞，无脑畸形的关键特征可以重现，无脑畸形是一种病理状态，显示大脑中这些褶皱部分缺失。

时空的控制

器官发生是由干细胞组织自身及其后代的内在能力驱动的。然而，类器官研究表明，干细胞的自组织能力不足以产生功能齐全的成熟器官。在体内，组织发育受到以精确的空间和时间顺序提供的外部刺激的影响，这在传统的3D培养系统中通常无法复制，在传统的3D培养系统中，细胞被嵌入各向同性基质中，并均匀地充满生化生态位信号。这一限制可以通过3D培养基质来解决，3D培养基质可以在时空控制下释放或呈现生物分子。通过微流控装置输送形态梯度可以进一步诱导可控的对称性破缺，从而实现可复制的类器官形成。例如，微制造装置可用于产生稳定的SHH激动剂和骨形态发生蛋白(BMP)的相对梯度，模拟脊髓发育过程中椎管神经管模式中重要的体内形态发生梯度。这种基质使胚胎干细胞的分化在空间上受到控制，类似于体内发育。SHH也可以通过基因工程人类PSC细胞表达到前脑类器官系统。这些PSCs可以被放置在发育中的脑类器官的一侧，从而产生形态梯度，最终导致前脑类器官的背腹状和前后状极化。

通过使用工程方法对生长基质进行直接图图化，也可以实现对生化线索呈现的时空控制，与微流体诱导的梯度相比，这种方法允许更大的宏观尺度控制。例如，促进细胞迁移和分化的多种生长因子可以通过双光子光化学在琼脂糖水凝胶中独立地空间特异性固定。此外，ECM成分对干细胞的分化有很大的影响;例如，层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别促进体外ESCs的心肌细胞和内皮细胞分化。同样，ECM配体组成需求也随着肠道类器官成熟度的增加而变化。在天然肠道中，隐窝-绒毛轴以ECM蛋白的梯度为模式，并且单个ECM成分在肠道干细胞稳态和分化中发挥特定作用。因此，生物工程方法，如3D基质沉积，可能会进一步改善肠道类器官培养中的隐窝绒毛区域化或其他类器官系统中类似的对称性破坏事件，通过预先定义的方式指导模式。

除了空间传递的线索，时间控制也可能是必要的，以再生产生具有高水平成熟的类器官。例如，光化学允许设计出响应于光刺激而局部释放可溶性化学因子(或暴露被掩盖的化学因子)的基质。尽管发展了各种各样的光化学，但这些材料在类器官培养中的应用仍未得到充分的探索。在肠道类器官中，光激活的局部形态因子释放可能潜在地实现对隐窝样芽形成的时空控制。同样，在肠道类器官发育过程中，ECM的机械性能也在不断变化，这可以通过引入光介导的合成生长基质的机械性能变化来解决，例如，使用光降解水凝胶。同样，支架的几何形状可以随着时间的推移而改变，以指导新兴类器官的形状，例如，通过依赖光的原位激光消融。

总之，尽管基本生态位模仿促进了类器官培养系统的产生和维持，但这些类器官在成熟度和功能水平上往往表现出高度异质的形状和随机变异性。工程基质有望在空间和时间上改善对形态发生信号的控制，因此，不仅在其组成元素上，而且在其动力学上，提供了模仿组织微环境的机会。因此，下一代工程材料有望进一步扩大可在体外生长的类器官的数量，并提高已建立的培养物的发育稳健性。

设计生物体级别的环境

在体内，器官发生是由细胞生长的直接生态位刺激调节的。然而，器官发育也受到高阶输入(由周围组织及其功能提供)以及系统级参数(如流体流动、机械力或pH值或氧水平的变化)的指导。类器官不容易在整个生物体环境中整合;然而，这种整合将需要生长生理上相关的稳态器官模型。

可获得性

类器官，如胃肠道类器官，由于其封闭的囊状结构和不断扩张，需要定期分解并重新播种到新的培养物中，这使得它们与长期研究本质上不相容。此外，功能原位读数和涉及病原体的实验需要进入类器官的顶端侧。通过应用低通量显微注射或使用倒置的、由内而外的类器官，可以克服类器官的不可接近性;然而，这些策略仍然具有挑战性，并且效率低下。或者，极化肠和结肠细胞单层可以在二维可渗透聚合物膜上产生;然而，这种方法排除了三维组织生物学的建模。通过利用工程方法设计一个类器官系统，可以更好地解决难以接近的问题，该系统可以方便地进行实验并长期维持上皮。例如，微流控装置是很有前途的工具，可以整合废物清除和类器官内营养供应的通道，并实现对实验条件的独立控制。

机械生理参数的整合

机械参数，如流量、剪应力、压力和运动，也对形态发生和组织稳态有影响。例如，血流诱导的内皮剪切应力触发内皮细胞的终末成熟。同样，不同的物理力量参与正常和病理肠道功能。这种组织水平的生物力学刺激在传统的类器官培养中是缺乏的，在当前的设置中不容易实现。因此，机械生理参数的结合要求对类器官的设计原则进行审查，考虑涉及自组织结构及其在允许产生力和运动的设备中的集成的组合方法。

芯片上器官技术引入了许多产生力和维持流体流动的技术;然而，这些系统的相关性经常受到质疑，因为所使用的细胞系没有表现出细胞多样性。利用芯片上的器官装置，单个胃类器官已经在芯片上培养，微移液管可以进入其管腔室，施加管腔流动和压力循环，以诱导蠕动样的运动。虽然这些外部刺激对细胞的影响尚未被研究，但该系统说明了在类器官培养中整合生物物理因素的工程方法的可能性。类似地，肾脏类器官在芯片上生长，并通过施加流体流动暴露在剪切应力下。液体流动的存在不仅促进肾类器官(包括肾小管和肾小球室)的成熟，而且有利于形成具有可灌注管腔的血管网络(图6)。

图6:类器官培养的系统环境工程

在血流诱导的剪切应力下生长的肾类器官显示出明显增强的血管化和成熟。共聚焦显微镜图像显示不同流动条件下的类器官:细胞核(DAPI，蓝色)，脉管系统(MCAM，黄色，PECAM1，红色)和足细胞(PODXL，青色)被染色。DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole;MCAM，黑色素瘤细胞粘附分子;血小板与内皮细胞粘附分子1;podocalyxin样蛋白。

类似芯片上器官的装置也允许上皮细胞在二维膜上生长，在顶端和基部都有微流体通道，提供双边可达性和施加流体流动的能力。肠道类器官形成细胞，在这种微芯片上播种，生长成具有绒毛样皱褶的功能性上皮，如果也暴露在模拟肠蠕动和管腔流动的机械拉伸循环中。这种基于微结构的设备提供了结合生物物理和生化刺激的机会，从而增加了体外模型的生理相关性及其生成方案的稳健性。

多器官系统

许多生理功能和病理状况不是归因于一个特定的器官，而是来自多个系统的相互作用。目前的类器官不能模拟更高层次的生物相互作用(例如，组织-组织或多器官相互作用)。芯片上的器官为结合类器官技术的多器官系统工程奠定了基础。例如，一种微型制造系统将乳腺癌模型与肠道和肝脏模型结合起来，模拟抗癌药物的顺序吸收、代谢和靶向生物活性。这种方法已经扩展到制造一个13个器官的工程综合体，称为“芯片上的身体 body-on-a-chip”，显示出令人印象深刻的组织活力和基本的生理功能(尽管只有5个细胞系被用作概念验证)。整合芯片上器官和类器官的协同方法可以近似天然细胞库并显示(病理)生理相关性。例如，在包含胃、肠和肝类器官的基于微流体的三方培养中，可以实现依赖旁分泌信号的胆汁酸产生调节，再现生理器官-器官相互作用。类似地，使用生物打印和微工程方法建立了心脏-肺-肝模型，允许器官间的串扰。有趣的是，这一装置为抗癌药物的肺依赖性心脏毒性提供了证据，强调了多器官方法在药代动力学筛查中的必要性。

将免疫成分整合到类器官系统中仍未被探索。免疫系统不仅在传染病中发挥核心作用，而且在其他病理和正常的体内平衡中也起着重要作用。因此，(疾病)模型系统中免疫成分的整合大大提高了它们的相关性。病毒感染(如脑类器官中的寨卡病毒、细菌感染(如胃类器官中的幽门螺杆菌或寄生虫感染(如肠道类器官中的隐孢子虫)已在类器官中进行了模拟;然而，由于完全或部分缺乏重要的免疫成分，这些研究可能缺乏相关性。例如，胃幽门螺旋杆菌感染通常会无症状地持续数十年，最终增加胃溃疡疾病和胃癌的风险。如此长时间的持续是由紧密的宿主-微生物相互作用实现的;例如，细菌可以通过干扰T细胞向抗炎调节表型的分化来逃避免疫系统。这种免疫逃避机制可以在上皮细胞、细胞毒性T细胞和细菌的三重共培养中进行研究，从而鉴定出幽门螺杆菌诱导的检查点抑制剂程序性细胞死亡配体1 (PDL1)180的诱导。在IBD等非传染性疾病中，微生物群、上皮细胞和免疫系统之间的相互作用同样起着至关重要的作用。因此，类器官是阐明IBD机制的有希望的平台。例如，含有结肠类器官衍生的上皮层的平台可以使用含有胶原的生物工程支架与单核细胞衍生的巨噬细胞作为免疫室进行补充。模拟大肠杆菌诱导的上皮炎症导致巨噬细胞迁移和促炎细胞因子的产生增加，已知这与IBD有关。在类器官系统内长期维持免疫细胞的方案尚未建立;然而，这些开创性的研究强调了类器官在免疫学研究中的潜力。

综上所述，研究高级类器官的方法不仅要考虑特定器官的局部生态位方面，还要考虑系统水平的背景。与传统的类器官系统相比，系统参数的近似有望产生寿命更长、表型更成熟、细胞多样性更高的类器官，并最终具有更高的临床预测性。这些系统参数包括生物物理力和菌株，与其他细胞和类器官类型的生化信号，以及营养供应和废物清除。

提高读出（readouts）

由于缺乏适当的功能读数，使类器官系统的效益最大化受到挑战。到目前为止，类器官研究主要依赖于表型读数(即类器官的外观，形状和数量)(表1)。然而，充分执行类器官的承诺将需要集成连续，准确和多功能的功能读数，这些读数可以以高通量的方式自动化，以实现基础研究以外的应用。

表1 类器官研究的分析方法

Cfu，菌落形成单位;ECM，细胞外基质;ELISA，酶联免疫吸附试验;质谱法;聚合酶链式反应;PTMs，翻译后修饰;scRNAseq，单细胞RNA测序;Vm、Rm、Cm分别为跨膜电位、电阻、电容;WB, western blot。

基于图像的分析

光学观察可能是生物学研究中最古老的技术，也是最强大的分析方法之一。然而，典型的类器官是在3D矩阵中生成的，并且生长在不受控制的位置，这使得自动实时成像具有挑战性。为了实现活细胞成像，可以通过使用微孔阵列或通过在微流体装置中捕获细胞来设计类器官生长位置。例如，肠道类器官可以在聚集后被捕获在微柱阵列中，以监测形态变化(例如肿胀)。类似地，肝类器官可以在芯片内直接生长和分化，以便进行下游分析。然而，尽管形态学分析提供了一些信息的见解，更直接的证据关于细胞的分子和功能状态将是可取的。例如，基因工程报告细胞系，由于在人类细胞中发展这类报告细胞系存在技术困难，传统上主要用于鼠类器官，最近也应用于人类类器官。使用基因组编辑技术，可以在人类类器官中提高产生敲入蛋白(即荧光报告序列)的效率，从而为非侵入性、实时监测不同细胞状态甚至亚细胞蛋白定位提供了机会。

一些创新的基于成像的策略已被进一步应用于体外生长的类器官的生理参数测量。例如，连续磷光寿命成像显微镜的O2敏感探针允许跟踪氧水平，揭示肠道类器官高度不均匀的氧合水平。工程F?rster共振能量转移为基础的方法也被用于研究细胞内蛋白质活性(例如，细胞外信号调节激酶(ERK))。

原位电化学探测

尽管基于成像的读数有巨大的机会，但基本的光学原理挑战了它们的忠实报告。特别是，类器官具有复杂的3D形状，并且嵌入在非均匀的矩阵环境中，这不可避免地会导致光学人工制品。辐射测量方法已被证明可以部分补偿伪影，因此比基于强度的方法更好;然而，由于光的散射和吸收是波长相关的现象，它们的精度仍然有限。此外，尽管最近取得了突破，但下游数据处理和分析管道的自动化仍然具有挑战性，这是由于成像参数往往不均匀，以及感兴趣区域的分割问题反复出现(即目标与背景分离)。相比之下，电化学传感器提供1D数据集，实现简单，无偏和自动化的下游分析。电化学传感器的确是准确和通用的，但是它们在类器官培养系统中的广泛应用受到其体积庞大的性质的阻碍，而小型化的传感器直到最近才被集成在一起。

一种双器官微流控装置(包含心脏和肝脏类器官)已经配备了多种集成的物理、生化和光学传感能力(图7)。除了温度、氧气和pH值传感器外，该装置还包括微制造的免疫生物传感器，用于连续监测分泌的可溶性生物标志物。检测机制基于无标记原理，利用抗原与固定抗体结合时氧化还原探针电子转移动力学的变化。重要的是，再生过程使传感器可以在很长一段时间内重复使用。此外，所有传感器都直接连接到一台处理计算机，该计算机驱动传感器和气动阀进行流体控制，这表明了全自动培养平台的可能性。

图7: 活体类器官监测的微工程平台

使用微流体装置可以实现类器官培养物中物理和生物参数的自动化和连续原位监测。该设备包含多个隔间，用于同时生长不同的类器官，以及用于监测各种生物(例如，代谢物和生物标志物)和生物物理(温度，pH值和氧气水平)参数的传感器。生物传感器被设计为可再生的，允许连续测量(插图)。APAP即对乙酰氨基酚;谷胱甘肽s -转移酶。

一个主要的挑战是测量超低体积的细胞分泌分析物。事实上，这些数据将捕捉细胞的功能状态，因此对药物毒性和药物筛选分析特别有趣。因此，人们努力将生物传感器整合到小器官模型系统中。例如，代谢物，如乳酸盐，离子或蛋白质生物标志物，可以使用电化学传感器进行监测。

迈向高吞吐量装置或器件

对于药物筛选应用，同时培养和分析大量类器官以增加统计能力并并行筛选数百到数千种候选药物尤为重要。通过结合成像方法和微加工策略，可以同时分析大量的类器官。微流体平台还允许按尺寸预先选择类器官，从而使基线类器官群体均匀化并减少可变性。液滴微流体是一种很有前途的细胞包封技术，但在类器官研究中仍未得到充分开发。水凝胶胶囊可用于类器官的聚集、生长和操作。例如，嵌入在基质珠中的前列腺和乳腺细胞在时间和空间可控的条件下增殖和分化。这种包含封装细胞的Matrigel珠也以自动化的高通量方式生成。这产生了大量具有均匀大小，组成和细胞分布的微胶囊，并开辟了高通量测量的可能性，如大颗粒流式细胞术。这些微珠易于操作，因此可以控制单个类器官的操作。同样，分化为内胚层、胰腺祖细胞和内分泌细胞的人类iPSCs可以被包裹在水凝胶胶囊中，在水凝胶胶囊中，它们以前所未有的一致性形成功能性类器官。这些方法能够自动生成大量类似的类器官，这是自动化大规模筛选的必然要求。综合方法有望极大地促进类器官筛选平台的发展，包括药物发现的自动化、连续和功能性读数。

结论与观点

体外类器官模型可以从各种器官的细胞中获得，通常在微观组织结构和细胞多样性和关键功能的再现方面与体内同类器官具有惊人的相似之处。然而，最大限度地提高它们的翻译相关性和适用性仍然存在挑战。解决这些挑战需要对类器官的设计原则进行重新概念化。临床转化的最大障碍之一是类器官的生长环境不明确，这导致了所产生的类器官表型的高度可变性。事实上，仅仅依靠细胞内在的自组织，对细胞命运和形态发生的外部控制留下了很少的实验空间。因此，需要设计的环境不仅要支持干细胞的维持，还要允许生物活性信号的精确时空调节，以指导类器官的生长。例如，水凝胶化学和器官芯片技术可以应用和结合，以更好地模拟干细胞生态位，不仅在体内生化线索的传递和呈现方面，而且通过整合传统培养系统中缺乏的生物物理和拓扑参数。

在更基本的层面上，基因工程细胞的行为可以增加类器官的功能相关性，例如，通过调整对特定实验刺激的反应或通过驱动稀有细胞类型的分化。基因工程(诱导)促进细胞分化确实可以绕过体内观察到的漫长的内在分化时间尺度。将生物水平的参数整合到类器官培养物中仍然没有得到充分的探索。在体内，组织对流体流动、力和应变的存在作出反应并共同发育，并且在相互作用和相互作用的背景下与其他组织和器官相互作用。整合这些系统级参数将有助于增加类器官的生理相关性，并使体外长期研究成为可能。此外，准确、高通量的功能读数与类器官培养本身的优化同样重要。在功能水平上需要对类器官进行精确的表征，否则，将错过许多微妙的细胞反应，这些反应通常在类器官中没有立即的形态学影响，从而排除了临床相关性。因此，将生物工程策略应用于传统的类器官培养方案将迎来一个新的类器官发展时代，并促进其转化为现实应用，实现许多尚未实现的类器官领域的承诺。

复杂程度的问题仍然存在，也就是说，多简单才足够复杂。需要为给定的应用程序选择合适的模型系统，记住复杂性通常是以牺牲实验控制和吞吐量为代价增加的。类器官比传统的二维细胞培养更类似生理细节，但在系统级过程方面不如动物模型。尽管利用工程方法可以使类器官变得更加健壮和具有更强的生理学相关性，但它们可能永远不会像基于细胞系的模型那样健壮和可复制，也无法完全再现动物模型的复杂性。因此，为了能够选择合适的模型，需要一组具有不同复杂程度的类器官。所需的复杂程度应该与需要建模的过程的规模相关联。例如，细胞过程和均质组织的研究不需要复杂的类器官;相比之下，干细胞自组织、大脑发育或微生物感染的研究需要复杂的类器官来实现精确的实验控制。通过结合免疫细胞或间充质细胞更准确地模拟器官和相关疾病，可以增加类器官的细胞复杂性。类器官领域在各种背景的研究人员中非常受欢迎，因此，各种协议正在开发，其趋势是为特定应用量身定制更复杂的系统。这些丰富的新方案可能最终导致更优越的类器官;然而，标准化将具有挑战性。因此，需要为单个类器官系统制定指南、质量措施和验证程序。

在这篇综述中，我们主要讨论了类器官系统作为基础研究和药物开发应用的体外模型所面临的挑战。然而，类器官也是很有前景的组织工程平台，这需要在体外构建大规模的组织和器官，以便随后移植以替代受损或病变的器官。类器官系统还不能满足工程组织的要求，因为人工制造的器官必须不含动物成分(因此，Matrigel不能使用)，完全安全(没有致瘤性风险)，并且在厘米到分米的尺度上生长，具有微观和宏观控制的结构。此外，工程组织必须表现出生理上相关的组织功能水平。自下而上的组装方法能够精确控制细胞沉积在促进生长的基质内。事实上，类器官和细胞球体已被用作大规模体外组织工程的构建模块;然而，单一球体和类器官的精确操作直到最近才通过使用生物打印技术和基于微室的方法来实现，例如，通过融合含有心肌细胞和含有心肌成纤维细胞的球体来生长高密度的心脏微组织，或通过融合间充质和内皮球体来生长成骨组织。为了避免打印具有预制图案的过于复杂的3D结构，我们最近通过打印具有类器官形成能力的干细胞来形成具有类器官样微尺度自组织的厘米级多器官结构来寻求一种补充方法。类器官和类器官形成细胞的生物打印仍处于起步阶段;然而，它可能为在组织工程中使用类器官打开大门，使功能器官的形成和人工组织的大规模生长成为可能。

参考文献
Hofer, M., Lutolf, M.P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials, 6, 402–420 (2021). https://doi.org/10.1038/s41578-021-00279-y