四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术（九）

5.4.2 动物角膜的冻干

理想的角膜保存方法要满足技术简单、最大限度地保持角膜组织的活性、保持生理状态下角膜厚度和结构、有利于手术操作等要求。现有的角膜保存技术中，除了最有代表性的4℃湿房短期保存法外，还有受者血清保存法、器官培养保存法、甘油冷冻保存法、深低温冷冻保存法和无水氯化钙干燥保存法，这些方法都没能满足上述理想保存方法的要求。角膜冷冻真空干燥的目的是保持其活性，便于较长时间的贮存，使需求者能及时得到活性角膜，以便再植。

 5.5.1 角膜的冻干工艺流程                  

冻干角膜保持活性的关键是冻干工艺，角膜的冻干工艺是一个复杂的过程，如图5-12所示。影响冻干效果的因素很多，如保护剂的配制、角膜的冷平衡、梯度降温、冻干室内压力变化、温度变化，冻干角膜复水等。东北大学的王德喜对角膜的冻干进行了系列研究。研究中使用的是中国医科大学临床医院动物室提供的大耳白家兔，体重为2～3kg。

 5.5.2 角膜冻结过程中的冷平衡            

角膜在梯度降温过程中，要经受-150℃以下的低温损伤，在干燥过程中，要经受干燥应力的损伤，在没有保护剂保护情况下，经历如此损伤，角膜细胞很难保持活性。合理的选择和配制保护剂对角膜的保存至关重要。实验研究表明角膜由蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、20%安普莱士（人血白蛋白）作为保护剂，冻干效果良好。

为了防止角膜在冻结过程中损伤，还要对角膜进行冷平衡处理。冷平衡保护剂的具体配比见表5-12。具体操作过程：将无菌的角膜片先放入1号液，移入4℃冰箱冷平衡10min，然后用无菌镊子夹住巩膜边，将其移人2号液平衡10min，依次在3号液、4号液中各平衡10min。冷平衡工艺如图5-13所示。在冷平衡过程中，保护剂中的DMSO通过角膜的细胞膜进入到细胞中，置换出其中部分水分，在达到动态平衡前，保护剂中DMSO浓度要高于细胞中DMSO浓度。角膜依次在不同浓度的保护剂中进行冷平衡，这样角膜中的水分就会不停地与保护剂中的DMSO进行置换，经过一段时间的传质，细胞中的水分将大量减少。由于细胞内水分溢出速度与DMSO的浓度有关，为防止细胞内水分溢出速度过快造成细胞的损伤，使角膜细胞有个适应过程，角膜冷平衡采取逐步递增DMSO浓度进行平衡。冷平衡处理后兔角膜内皮细胞经联合染色检测，结果与新鲜角膜无区别，说明冷平衡对角膜内皮细胞的活性无损伤，该冷平衡工艺可行。

待角膜在4号液平衡结束后，立即取出放入磨口玻璃瓶里，在降温仪中进行梯度降温。梯度降温目的是使细胞内的溶液冻结成玻璃态，以使角膜迅速越过对细胞冻伤最严重温度区（-30～-60℃）时，细胞不受伤害。采用两步法进行梯度降温，第一步角膜距液氮面9cm，停留l0min，使角膜内部温度稳定在-16～-20℃范围内，此阶段角膜的降温速率为2～2.4℃/min;第二步角膜距液氮面1.5cm，停留10min，使角膜内部温度稳定在-130～-150℃范围内，此阶段角膜的降温速率为11～14℃/min。慢速降温时，细胞外的水易冻结成冰，电解质浓度升高，细胞内的水渗出细胞外，使细胞暴露在高浓度的溶质中，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解，造成溶质损伤。快速降温时，细胞内的水来不及渗出便结成冰，细胞内外同时有冰晶形成，容易刺破细胞造成机械损伤。这样必须快速慢速相结合，方可达到目的。由于冷平衡时，二甲基亚砜已经将细胞内的水分多数置换出去，在缓慢降温时，细胞内的溶质易形成玻璃态，可以避免溶质损伤。故可以先慢速降温，然后快速降温。两步法降温中，第一步慢速冷冻，将角膜温度慢速降至-20℃，可以避免过快冷冻时角膜内冰晶形成所造成的损伤和过慢冷冻时细胞置于高浓度溶液下时间过长所造成的溶液损伤。第二步快速冷冻，角膜以很快的降温速率降至-130℃以下，细胞内未冻溶液实现了非晶态固化，使细胞少受或不受损伤。