四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术（八）

5.4 骨骼和骨髓干细胞的冻干

骨病和创伤引起的骨缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因之一。骨组织工程的提出、建立和发展为从根本上解决骨缺损的修复、结构以及功能重建提供了新的途径，但目前的组织工程骨构建需要较长的时间且保存条件苛刻，不能达到“随取随用”的最终要求。1942年古巴医生Inclan提出骨库概念，1950年美国首先在马里兰州建立海军组织库。骨库的建立使临床异体骨移植成为可能。

5.4.1 冻干骨的生物性能

早期保存异体骨的方法主要是冷冻和冻干处理，而冻干骨更被看好，来源包括肋骨、髂骨、下颌骨。这一点在后来Malinin等的动物实验得到了证实。他们以9只狒狒为实验对象，将冷冻骨与冻干骨分别植于动物胫骨近端对称部位并做了组织学观察，结果发现冻干骨不仅可以诱导成骨，且成骨速度优于冷冻骨。Sewell等分别在猴子下颌骨下缘两侧造成17mm×5mm的缺损，结果一侧接受异体冻干骨移植的6只猴子其下颌骨块处均获得愈合。Pike和Boyne采用大段冻干骨和自体骨髓复合进行了狗和猴子下颌骨重建，证明异体冻干骨易于被宿主接受，但是6例实验中有2例与口腔穿通将自体骨冻干后植入狗的节段性骨缺损获得了成功，结果经统计学分析显示自体骨冻干前后的孔隙率、植入骨与宿主骨的愈合时间、新骨骨痂形成量、成骨后的力学强度等均无显著差异。

1990年后，大段同种冻干异体骨移植研究继续发展，国内外众多学者分别进行了冷冻骨移植的临床实践，但整体来说大段异体骨移植还面临动物实验过少、临床工作不系统的问题，目前自体骨移植在矫形外科依然占据绝对主导地位。同时，随着骨库的蓬勃发展，以Stevenson、Enneking等为代表的一批学者做了大量基础和临床研究，大段同种异体骨移植在骨科得到了广泛和成功的应用。1993年Ellis等采用冻干异体骨结合自体松质骨进行了10例下颌骨重建，随访3.5年8例获得成功，2人出现并发症经过手术处理恢复良好。

通过对西南医院数百例冻干异体脱钙骨基质(FDBM)使用患者的随访观察，使用冷冻和冻干处理三个月以上的异体骨降低了原本的免疫活性，虽有抗原残留但可以忽略其不良作用。自1965年Urist率先研究同种异体冻干骨的成骨功能以来，冻干脱钙骨基质(FDBM)在临床应用逐渐广泛。FDBM有良好的孔隙率及孔隙间连通率，同时还保留了一定的骨诱导能力，其表面拥有矿物沉淀的位点，能与启动和控制矿化的非胶原基质蛋白结合，因此还能促进矿物质的沉淀，促进骨生成。FDBM是应用特殊工艺制备的生物骨替代材料，由于精细的骨小梁结构和内部孔隙被保存下来，同传统骨替代材料羟基磷灰石等相比具有较好的生物活性，近年被引入国内并很快应用于种植外科。Iwata等总结了FDBM的优点：保留部分骨诱导成分，能常温贮存而基本不变质，可快速降解并被宿主骨替代，能长距离发挥骨传导作用。

我国解放军总医院口腔颌面外科许亦权等的研究表明，冷冻干燥骨具有骨抗原性更低、保存条件宽松的优点，是骨库另一常用异体骨保存方法。但有人提出冷冻干燥处理将异体骨中的水分在短时间内降低到6%以下，造成骨胶原纤维发生微小裂隙，因此可以导致力学性能降低，也有人认为使用之前充分水化可以改善这一缺点。目前冷冻干燥法较多用于处理松质骨块，四肢大段承重部位骨不进行冷冻干燥处理，关于皮质骨接受冷冻干燥处理后力学性能特点的报道较少。许亦权的研究中采用的冷冻干燥骨试件测试前经过了6h水化，结果发现：与新鲜组相比，冷冻干燥组在抗压缩测试中最大载荷、最大位移降低，刚度升高，但是配对检验均无显著性意义，方差分析最大位移显著降低；在抗弯曲测试中冷冻干燥组的最大载荷降低30%，刚度升高41%，统计学差异显著。这一结果与冷冻组表现出的特点相似，统计结果也显示冷冻干燥组与冷冻组相比最大载荷、最大位移和刚度均无显著性差异。这说明经过冷冻干燥处理的犬下颌骨硬而脆，抗弯曲能力下降比抗压缩能力下降明显。像冷冻组一样，经过水化的冷冻干燥犬下颌骨仍然可以保持良好的外形并能提供较好的支持能力。

侯天勇进行了冻干组织工程骨(FTEB)与组织工程骨(TEB)活性比较研究。取志愿者捐献的骨髓和骨组织分别培养(hBMSCs)和制备脱钙骨基质(DBM)，取第3代hBMSCs与DBM复合构建TEB，分别于体外孵育3d、5d、7d、9d、12d、15d经过低温干燥后得到冻干组织工程骨。将FTEB、TEB和DBM分别移植于30只6周龄BALB/C裸鼠皮下进行异位成骨实验。移植术后4周各种移植物未见明显钙化；术后8周、12周，TEB和FTEB移植裸鼠皮下可以实现较好的异位成骨。通过X线片评分、CT值比较移植物钙化程度，TEB和FTEB差异无统计学意义，而DBM未见明显钙化。HE染色显示TEB和FTEB出现钙化，DBM降解吸收。可见，FTEB与TEB具有相似的成骨活性。