四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术（六）

5.3皮肤的冻干   

冻干皮肤在医学上的临床应用研究始于20世纪50年代。动物皮肤的冻干目的是用于对药物经皮肤渗透性的研究。由于透皮吸收给药新型的问世，药物经皮渗透性的研究正成为开发这类新型筛选药物的重要手段，由于大量长时间动物皮的需求，实际应用时常将待用皮放在冰箱里，可保存1周左右。时间再长，不但影响药理实验的稳定性，而且皮肤将变质。为增长皮肤保存期，可将动物皮肤冻干保存；人类皮肤冻干的目的是用于再植，为烧伤或外伤皮肤的病人植皮。

5.3.1 大鼠皮肤冻干工艺及药物渗透性实验

东北大学的郑文利博士早在20世纪末就进行了大鼠皮肤冻干的实验研究。取活大鼠脱颈处死后，立即用电动去毛刀去其腹部鼠毛，剥离皮肤，除去皮下脂肪层、血管及残留物，用蒸馏水冲洗干净，制成不同尺寸的皮片，再用生理盐水冲洗数次备用。将制备好的大鼠皮放在速率降温仪中，以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三种不同速率降温至-30℃。将三种不同降温速率预冻的大鼠皮，分别放入小型冻干机中抽真空，30min后压力稳定在120Pa,不主动加热，连续干燥34h后关机，充氮气后取出，用无菌塑料袋封装后，放在干燥器内保存。

将以不同预冻速率冻干的大鼠皮肤，经10%福尔固定，石蜡包埋制片，进行病理切片，切片厚度4～5μm,HE染色，再显微镜观察。新鲜大鼠皮组织切片如图5-8所示，以5℃/min速率预冻并冻干大鼠皮组织切片如图5-9所示。从图中可以看出冻干皮组织与新鲜皮组织相本相同，未见细胞破裂、上皮脱离、组织褶皱、细胞变性和细胞间隙增宽等异常，说明冻干皮组织结构未发生变化。其他速率预冻并冻干后的结果基本一致。

冻干大鼠皮角质细胞间隙脂流动性的电子自旋共振(ESR)测定：选  用5-噁唑氮氧自由基硬质酸(5-DSA)作为自旋转标记物，将新鲜的和  三种不同预冻速率的冻干大鼠皮角质层样品泡在浓度为1×10-4mol/L  的5-DSA缓冲液(pH=7.4)中12h，保温20℃，然后取出淋洗干净，37℃烘箱干燥1h，分别放进电子自旋共振波谱仪样品管内，再置于腔中。ESR测定条件：扫描宽度200G，接收增益3.2×104，时间常数20.48ms，微波功率5.02mW，扫描时间83.888s，调制频率  25.000kHz，调制幅度0.947G。经ESR波谱分析得知，三种不同冻  结速率预冻的冻干大鼠皮与新鲜大鼠皮各系数相比无显著差异，说明  冻干大鼠皮肤未引起表皮细胞间脂质结构的变化，大鼠表皮角质细胞  间脂质排列的有序性没有改变，流动性没有增加。

实验采用尼莫地平为模型药物（一种脑血管扩张药），选用预冻速  率为l5℃/min的冻干大鼠皮和新鲜大鼠皮做药物渗透性实验，考察其  组织结构有无变化。实验采用装置为V-lia-chien水平扩散池。它是由  两个等容积的玻璃半池组成，半池内径为l.35cm，有效扩散面积为  1.43cm2，容积为10mL。半池上方开口为取样口，池底有凹陷平  台，起到固定搅拌的作用。实验时将皮肤固定在扩散池的两个半池之  间，角质层面向供体池。水化1h后，供体池加入10mL尼莫地平的  30%丙二醇水过饱和溶液，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置  于32℃温水浴中，磁力搅拌，定时取样并更换全部接收介质。样品经  徽孔滤膜(0.45nm)过滤，续滤液，样品进人高效液相测定。尼莫地平  外含量测定采用高效液相色谱法紫外检测。色谱条件：色谱柱  Spherisorb46mm×25cm，检测波长237nm，流动相是甲醇/水  (64/36)，流速为1.1mL/min，进样量10μL。实验结果如表5-11所  示。

表5-11正常皮肤和冻干皮肤对尼莫地平渗透量比较

表5-11中的数据表明，在渗透9、10h、12h时，冻干皮肤与正常皮肤对药物尼莫地的渗透量无显若性差异。可见，冻干的大鼠皮肤能够满足药理的实验要求，可用做透皮制的实验研究，可以长期贮存备用。