课堂 | 如何让样品保持在生理状态

Coral Life工作流将动态数据与最 佳的样品固定方式（高压冷冻）相结合。

Coral Life工作流将动态数据与最 佳的样品固定方式（高压冷冻）相结合。然而，如果您的细胞因为温度下降，或缺氧气、二氧化碳或营养物质缺乏而受到损伤，那么再好的样品保存也没有意义。这些因素将影响一系列的生物过程，甚至破坏原超微结构基础，影响您的分析。

因此，徕卡显微系统公司与Baker Ruskinn公司合作开发了一种方法，可使您的样品从细胞接种开始到高压冷冻，一直保持生理状态。使用这种解决方案，样品的生长、选择和成像没有任何时间压力。本文描述了控制氧气的重要性，以及Coral Life如何协同Baker Ruskinn公司解决氧气控制的问题。

为什么持续控制氧气特别重要?

氧气是大多数生命形态存在的基本要素。对于生命科学研究人员而言，氧气是一种电子受体，一种生命所必需的高活性分子，以及一种影响生物中每一个单一活动和反应的分子。一般情况下，大气含氧量被认为是21%。

然而，当吸入空气时，组织氧合下降到约5%。从肝至肺上皮中，氧气水平约为14%，肠粘膜腔实际上是无氧的。在这些百分比中，不同的组织中有不同的氧气水平，但最重要的是，没有一个组织的细胞会暴露在21%的氧气水平中。事实上，21%的氧气会形成活性氧自由基(ROS)及其中间体，因此对细胞具有高毒性。当产生的ROS超过细胞的抗氧化能力时，ROS就开始破坏大分子，如蛋白质、脂类和DNA。

缺氧是细胞和组织通过血流增加、血管舒张或上调氧应答基因对一定的氧气水平作出响应，以期维持它们的首 选氧气水平。这些响应会在氧气水平低于某一特定点后发生，这个点在各组织和细胞间各不相同。正常组织在3%到10%的氧气水平之间得以维持，低于该水平被视为低氧状态（最恰当的描述是缺氧）。

由于是在非生理条件下进行研究,因此,在很多，甚至可能是大部分的研究中都要隐藏生理表型。由此，了解各项研究中器官或组织的氧气水平，以获得可转移的和生物学相关的实验结果是很重要的。每个组织和器官都有各自的氧合状态，反映了各自的功能。当氧气含量过高或过低时，其影响涉及单基因表达到蛋白质组水平。

Baker Ruskinn公司的OxyGenie

OxyGenie是一个小型便携式孵育平台，可将您的样品保持在缺氧状态或您想要的空气中。OxyGenie可以由电源以及电池驱动，不管是在实验室，还是外面 , 您都可以控制样品状态。它由1至6个独立的1孔培养室组成，每个培养室有自己的进气口。OxyGenie配有两个循环充气瓶(Catalina Cylinders，美国加利福尼亚州)，可以充您想要的气体成分比例。通过调整气瓶的出口压力来调节气体流量。两个装满的气瓶可供6个样品室使用16小时。温度由ITO加热器和控制器（Okolab s.r.l.，意大利）控制。每个样品室下方都有一个6孔分流器，通过该分流器，细胞可以在不中断生理参数的情况下，例如在光学显微镜成像时与基底分离。

图1. A：Baker Ruskinn OxyGenie移动式孵化器。B：组装硅细胞培养孔

样品室经过优化，以实现高分辨率成像。样品室的底座为高质量的玻璃盖。每个样品都是一个迷你孵化器，配有不同的盖子和锁。经过优化的样品室可容纳1mL的样品培养基，并以光学透明玻璃盖密封。盖锁是为了预防潜在的蒸发。外盖锁将盖子牢固密封。最后一层外盖与系统的气体软管连接。

测量随时间变化的样品气体控制可参阅：Metsälä 等, “便携式系统可在体外同时缺氧的状态下进行多次辐射研究。(2018)”

为Coral Life改编

为了在整个活细胞CLEM工作流中维持合适的生理条件，我们利用了OxyGenie可以在冷冻固定之前确保细胞生理状态的能力。然而，为了适应工作流的需要，我们做了一些定制化的改变:

在EM ICE上进行高压冻结时，使用6 mm的蓝宝石盘作为样品培养皿。此外，为了实现最 佳的实时成像(见操作说明书：“如何使用Coral Life改进活细胞成像”)，能否在蓝宝石盘上实现水浸式成像至关重要。因此，我们将腔室底部的玻璃盖换成一个在中心有6.5 mm孔的35 × 35 × 1 mm玻璃载玻片（称为SampLink样品杯)。该孔与EM ICE中间板对齐，直达蓝宝石盘的中心。使用蜡封将中间板和蓝宝石基底连接到SampLink基杯的底部。中间板与SampLink基杯的对齐和连接见Coral Life操作手册的5.2节的描述。

成像后，EM ICE中间板必须快速脱离SampLink。因此，EM ICE加样区配备了滑动和分离机制，可将中间板从玻璃基底分离，并将其直接放置在正确的位置进行冷冻。

图2：为Coral Life准备的EM ICE加载区。

SampLink室的细胞活性和细胞毒性

为确保样品在改良后的SampLink室中保持活性，需要开展细胞活性和细胞毒性测试。实验使用哺乳动物的成纤维细胞系L-929 (ATCC编号CCL-1，批号13)，由奥地利维也纳的OFI技术与创新公司执行。细胞(105细胞/ ml)接种在蓝宝石盘上(50 μl)或整个样品室底部(500 μl)。作为对照，将相同的稀释细胞接种在96孔板(50 μl)或12孔板(500 μl)中。样品和对照品在37°C和5%二氧化碳水平下孵育24小时。测试细胞毒性，以评估牙蜡对种子细胞质量的影响(图3)。根据ISO 10993--5:2009标准测定细胞毒性。

图3：可见与EM ICE中板接触的、在蓝宝石盘侧的牙蜡(红色圈)。

为进行光学评估，用MTT对样品进行了染色

活细胞可将MTT转化生成甲臜，颜色由黄色变为紫色/蓝色，可通过光度计的吸收测量来检测。去除培养基，用50 μl或500 μl MTT溶液（DMEM中1 mg/ml）对细胞进行染色，在37℃，5%二氧化碳水平中孵育2小时。然后用50 μl或500 μl异丙醇替代染色剂。将溶液转移到96孔板上，在波长范围560 ~ 650 nm内测量吸收。细胞形态学的光学评估显示，试验样品和对照样品均为100%正常的成纤维细胞，如图4所示。

图4：用MTT染色的阴性对照样品

所有测试样品的细胞活性为85±7%

结合形态学的评估，Coral Life工作流清楚地显示，SampLink室作为非常合适的实验工具，可以在任何活细胞实验中，将您感兴趣的细胞保持在特定的生理状态。

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【应用笔记】如何让样品保持在生理状态（英）