四通道P4SPR用于乳糖操纵分子/乳糖阻遏（DNA-蛋白质结合）分析

导论
乳糖操纵子（lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因， 负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调节是分子生物学中一个被充分研究的系统。而乳糖阻遏物这一个DNA 结合蛋白（lacI）是控制乳糖操纵子的关键。 该系统的平衡解离常数（KD）通常估计在 nM 范围内。这种 lacO / lacI 系统通常在本科基因调控的生物化学和生物学课程中引入。更高级关于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色质编辑中的应用。 

在更广泛的领域里，SPR 对蛋白质-DNA 复合物研究在理解基因表达调节途径中有相当重要的地位。
在这篇应用笔记我们将分享蒙特利尔大学学术实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力，KD）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR 测定，以便于在本科实验课程中演示该生物系统。

图1 乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白组合

实验装置

系统设置

图2 台式P4SPR设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作控制和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。 首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。 S 形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供一式三份的样品测量以及与参考通道的一次控制测量。 通过透明通道可以在直接观察在通道中是否有形成的气 泡，以便立即清除而防止任何信号丢失。

图3 P4SPR微流体单元

实验步骤

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。 固定化自发地造成强金-硫键形成，直到 SPR 表面饱和后产生平台信号。 然后注射互补的 LacO 寡聚体以允许杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。 通过先前储备的液蛋白溶液来制备 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每种逐渐增加浓度的溶液， 并用其中的大量洗涤溶液和再生缓冲液孵育 10 分钟，以从先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有4 个通道的数据，然后导出到 Excel 进行进一步的数据分析。
 
结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。 对该信号进行平均后从参考信道信号中减去来取得 SPR 信号相对于时间绘制（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 KD（图 6）。
计算的 KD 为 6.4±1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录YZ蛋白的文献报道值1。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测结合相互作用。

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式，便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR 工具。 它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量和结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地展出乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可从之前发表的文献验证。 本科生可从该实验熟悉该 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。 此外，P4SPR 系统也可考察其他生物系统，如 DNA-DNA，RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合并揭示生物通路中的功能。
 
致谢
我们要感谢 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 SébastienTruche 开发该化验。
 

参考文献
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893