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近期爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19，对应的病毒为SARS-CoV-2）突出了开发有效ZL方法的重要性。在近期的公众号中，我们向大家介绍了“人民的希望”瑞德西韦的工作机制[1]，在此，我们结合疫苗、血清、多肽和单抗的研究案例，向大家继续介绍靶向病毒的大分子ZL和我们的解决方案是如何推动下一代ZL研究的。
No.1针对MERS的疫苗优化研究
中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，是近年来第二个造成大规模人群传染的冠状病毒，相较于SARS病毒，其致死率高、发病快，因此急需研发有效的疫苗用于被动免疫。在2015年由NIH的Barney S. Graham主导的研究中，科学家评价和比较了靶向MERS的多种疫苗方案[2]。
基于DNA和蛋白为免疫原的免疫流程，图片源自参考资料2。
围绕MERS冠状病毒的刺突蛋白(S)，研究构建了多种cDNA和蛋白免疫原，分别通过电转和配合佐剂的形式免疫小鼠。为了提升研究的安全性，科学家建立了带有化学发光报告基因的假病毒体系。通过检测由病毒感染所致的化学发光，研究利用可溶性DPP4（MERS 靶点）和DPP4抗体验证了假病毒的功能。
MERS假病毒功能性验证，左图：基于过表达技术验证DPP4过表达提升病毒的感染能力，Huh7.5内源性高表达DPP4。中图：基于可溶性DPP4的竞争实验。右图：利用DPP4抗体YZ假病毒的感染。假病毒的化学发光检测基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。图片源自参考资料2。
借助假病毒体系，研究追踪和评价了不同免疫策略产生的血清的中和能力和针对多种MERS病毒株的交叉中和能力。从结果可以看出，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案所获得的抗体Z为有效，且能中和多种MERS病毒株。通过进一步的竞争实验和血清吸附实验，研究证实不同的免疫流程得到的血清靶向的S蛋白位置也不一样。与经典的微量中和实验(Microneutralization)相比，研究证实假病毒体系评价抗体中和能力更为敏感，灵敏度约有一个数量级的提升。通过解析抗体的亚型，研究发现基于S DNA的免疫方案能诱导IgG2a为主导的免疫反应，而S1蛋白刺激则产生IgG1为主导的免疫反应。在小鼠中，IgG2a的出现反映了Th1型免疫反应，促进了抗病毒相关因子如interferon-γ的释放，提升了T细胞介导的抗病毒反应。因此，相较于蛋白，基于DNA的疫苗可以通过建立T辅助细胞免疫应答来更有效的控制病毒感染。
血清的交叉中和能力检测。假病毒的化学发光检测基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。图片源自参考资料2。
对应的，在非人灵长类动物（印度恒河猴）模型上，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案产生的中和抗体滴度优越于基于全程DNA的免疫方案。病毒接种后，相较于对照组，免疫组动物显著降低肺部病理指标。疫苗中DNA免疫原的引入更是进一步缓解肺部的损伤情况，并加速了康复过程。
基于非人灵长类动物（印度恒河猴）模型的疫苗评价。上图：免疫流程。下左图：动物血清中和实验，基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。下右图：通过CT评价疫苗的保护作用。图片源自参考资料2。
No.2基于转基因牛的抗病毒血清研究
在抗击SARS和流感的临床疗法中，“恢复期血浆”ZL(Convalescent‑phase plasma therapy)获得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，该法的LX很大程度上依赖于是否能及时获得有效的血清。相比下，基于动物的超免疫血清虽然能解决量的问题，但其使用可能会导致严重的免疫反应和毒性。单克隆抗体疗法，又一种基于被动免疫的ZL方法，面临耗时长和出现耐药突变病毒株等挑战。
为了解决上述的问题，有研究人员将目光转向了转基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)来快速获得大量、有效的抗病毒血清。通过基因工程，研究人员敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亚型人抗体表达体系，来达到免疫系统人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高达150到600 g的人IgG。目前，已有多项临床前研究利用该技术对抗MERS和Ebola等传染病[3,4]。在此，我们着重介绍靶向MERS的研究。
在免疫原段，该研究利用了两种材料：灭活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的纳米材料(SPNV)。两种免疫原均能刺激产生S蛋白特异的血清和人IgG(SAB-300/301)。基于安全性和生产可行性等因素，研究主要围绕基于SPNV产生的人IgG开展动物和临床研究。
上图：基于转基因牛的免疫过程。下图：利用Anti-Spike抗体检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）的有效含量。图片源自参考资料3。
除了特异性检测外，研究利用免疫荧光成像技术，结合Anti-Spike抗体来衡量免疫所得血清和抗体的抗病毒中和作用(FRNA50)。相较于只能完成一轮感染的假病毒体系，FRNA50能直观、全面地反映药物处理对于病毒感染能力的影响。在该研究中，此法还结合mRNA检测验证病毒的灭活效果，确保疫苗的安全性。结合FRNA50和传统的半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)测定法，研究证明纯化的血清含有高水平的中和多抗。在过表达DPP4的小鼠模型上，无论是预防性还是ZL性给药，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已进入一期临床试验。
利用FRNA50检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高内涵平台和配套微孔板。图片源自参考资料3。
No.3利用ADCC抗击H7N9禽流感的单抗研究
作为肿瘤免疫疗法的主要推动者，单克隆抗体（单抗）也被广泛用于抗击SARS和HIV等多种病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和单抗的研究也为疫苗设计提供了新的思路。但是，基于杂交瘤技术的传统单抗制备面临着耗时长，步骤多且繁琐等问题，限制了其对可能出现的新型疫情爆发的应对能力。相比下，噬菌体展示技术为快读获得高亲和力人源单抗提供了新的途径。基于该技术平台，复旦大学研究人员建立超大型天然全人源抗体库，并成功鉴定靶向MERS和流感的QL抗体[5,6]。
在抗击H7N9流感的工作中，为了获得低突变的高特异抗体，研究人员以重组表达的HA和HA1蛋白为抗原，基于健康人B细胞来源的天然抗体库开展多轮筛选，获得单抗m826。经序列分析，研究人员证明m826与胚系基因高度同源，是胚系抗体。相较于体细胞高度突变的抗体，胚系抗体建立时间短，安全性高且成药性更好，适用于靶向急性感染的抗体和疫苗研发。
基于噬菌体展示技术的H7N9抗体筛选，图片源自参考资料6。
非常有意思的是，在红细胞凝集YZ (Hemagglutination inhibition,HI)反应中，m826仅表现出微弱的抗病毒能力。进一步的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)检测和免疫荧光法中和实验证明m826不能中和流感病毒，YZ其在靶细胞的增殖。利用亲脂性荧光染料R18和SP-DiOC18（3）来标记病毒，研究发现m826对病毒与靶细胞的结合和膜融合过程无显著影响。但是，m826能很强结合表达H7N9 HA蛋白的细胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）活力的QL介导者。同时，由于不能中和H7N9病毒，m826还能成为高价值的工具性抗体。在动物模型上，IgG1 m826能有效的预防和控制H7N9的感染。因此，m826依赖于ADCC，而不是中和能力抗击流感病毒。这一发现为抗病毒抗体的筛选和研发提供了新的思路和途径。
左图：基于免疫荧光成像技术（荧光标记病毒）的中和实验，H7N4抗体为中和阳性对照。右上：病毒结合检测，红色荧光探针R18标记病毒，感染30分钟后进行成像检测。NA为结合阴性对照；m336为阴性对照抗体。右下：利用荧光探针R18和SP-DiOC18（3）双标记病毒，病毒膜融合发生会诱导SP-DiOC18（3）绿色荧光信号加强。Baf A1为融合阴性对照。上述高通量成像检测均基于Opera或Operetta高内涵平台。图片源自参考资料6。
No.4靶向膜融合的广谱抗病毒多肽研究
作为动物来源的病毒，冠状病毒因其多样性，较高的传播能力和进化能力限制了单一的靶向疗法的临床应用。因此，从长远角度来看，能作用于多种冠状病毒的新型广谱抗病毒 药物，会成为抗击流行性和新型冠状病毒感染的终 极武器。相较于高度变异的受体结合区(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)区高度保守。同时膜融合也是病毒感染和复制重要的功能性过程。因此，该区域成为了YZ性多肽的研究ZD。靶向冠状病毒的膜融合过程，来自于复旦大学的研究团队研发出广谱多肽YZ剂EK1，为抗击冠状病毒和类似病毒提供了新的大分子ZL策略[7]。
冠状病毒可通过胞内体膜融合途径(Endosomal pathway)或/和细胞表面胞浆膜融合途径(Non-endosomal pathway)进入细胞。病毒通过结合宿主细胞受体激活其S2亚基的HR1和HR2区，互相结合形成对膜融合至关重要的6-HB(Six-helix bundle)结构。
冠状病毒的膜融合过程和竞争性多肽工作机制，图片源自参考资料7。
鉴于此，研究人员以多种冠状病毒的保守HR区为模板，合成HR1和HR2区来源的多肽（HR1P和HR2P）用于竞争。通过过表达技术，研究进一步建立靶向多种冠状病毒的细胞细胞融合实验，系统性筛查HR1P和HR2P对细胞融合的YZ。结果显示由OC43株来源的HR2P具有广谱且的YZ融合能力。在此基础上，研究人员通过引入氨基酸和突变等方法，进一步优化多肽的可溶性和成药性。所获得的多肽EK1，在进一步的一系列体外检测，包括细胞细胞融合实验，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力检测中，都表现出的广谱抗病毒能力。
细胞细胞融合实验，过表达病毒S蛋白并带有GFP信号的293T细胞为作用细胞，Huh-7为靶细胞，
图片源自参考资料7。
除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽类药物的另一优势是支持非侵入性鼻腔给药，适合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，检测鼻腔给药下的EK1的体内分布非常重要。基于活体成像技术，研究观察到Cy5荧光标记的EK1可广泛分布于整个呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝脏、肾和脾，都能检测到EK1的分布，表明EK1可以进入血液循环系统和其他脏器中。因此，EK1还可能作用于由冠状病毒导致的系统性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表现出QL的抗病毒能力，有效YZ了因感染带来的体重减轻和死亡现象。从体外到体内的多方面安全性评价表明通过鼻腔给药的EK1是低免疫原性，安全的ZL策略。因此，EK1是一个新型、有潜力的广谱抗冠状病毒 药物，值得进一步的深入研究。
上：基于活体成像检测鼻腔给药下Cy5标记的EK1在小鼠体内的分布；小动物活体成像检测基于IVIS平台。下：EK1处理对模型鼠死亡率、体重和病毒滴度的影响，图片源自参考资料7。
总结
通过上述四个案例，我们总体介绍了靶向病毒段的大分子疗法的研究流程和关注点。助力此类ZL方法的研发，珀金埃尔默提供成熟的整体应用解决方案。针对携带萤火虫报告基因的假病毒研究，我们提供全面、配套的涵盖化学发光试剂，微孔板和高通量检测平台的解决方案。对于基于慢病毒包装系统的假病毒，我们还可以提供p24检测解决方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平台的解决方案，我们还可以分析短程和长程的复杂亚细胞活动，例如由病毒介导的膜融合过程。在血清和抗体的筛查和分析中，强大的高内涵解决方案能Z大程 度发挥表型筛选的优势，发现具有中和能力、安全的潜在抗体。同时，ADCC，作为关键的抗感染抗体工作机制之一，也是我们的主要应用关注点。针对ADCC的检测，我们提供金标准、灵活的放射和非放射解决方案，助力抗体类药物的深入评价[8]。Z后，在临床前动物研究中，除了中和检测外，我们提供覆盖功能到结构的活体成像解决方案，助力病理检测、药物分析和药效评价等核心工作。
参考文献
1. 药物机制解读 | “人民的希望”抗病毒 药物瑞德西韦(Remdesivir)https://mp.weixin.qq.com/s/MyJO1XjkD6uQAgsoMFTxEw
2. Wang L, et al. Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV. Nat Commun. 2015 Jul 28;6:7712.
3. Luke T, et al. Human polyclonal immunoglobulin G from transchromosomic bovines inhibits MERS-CoV in vivo. Sci Transl Med. 2016 Feb 17;8（326）:326ra21.
4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218（Suppl 5）: S636–S648.
5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.
6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22（4）: 471–483.e5.
7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5（4）: eaav4580
8. DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞ZL——AD0116细胞杀伤ZT之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ
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珀金埃尔默 
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