革兰氏阳性细菌细胞膜蛋白提取方法

分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶YZ剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶YZ剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶YZ剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl，5mMNacl，3mM Mgcl2，50mM Hepes，1mM DTT，0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl，5mMNacl，3mM Mgcl2，50mM Hepes，1mM DTT，0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf，50mMTris-cl(PH=7.0)，

分离细胞膜蛋白的方法：
1）细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4）溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5)收集水相留作分析
6）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶YZ剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
3)buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)

分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。

分离组织膜蛋白的方法：
1）取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2）J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3）100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA，1mM EDTA， 0.2mM PMSF， 1ug/ml Leupeptin， 1ug/ml Pepstatin A， 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100， 1mM EDTA， 1mM EDTA， 0.2mM PMSF， 1ug/ml Leupeptin， 1ug/ml Pepstatin A， 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

分离组织膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
以下用时加入
10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml)
Aprotinin（30ul/ml)
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml)

冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速离心30min，20000转低温离心Z佳。
取上清-20保存。

分离细菌膜蛋白的方法：
① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。
② 10000g、20min、4℃离心，去上清。
③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④ 超声波破碎细菌。
⑤ 3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
⑥ 超速离心I：100，000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。
⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。
⑧ 超速离心II：70，000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。
⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)
如何进行亚细胞结构的分离？
亚细胞构造的离心分离

一）简介：
　　用简易的差分离心结合各种型式的密度梯度离心可以分离和纯化各种亚细胞器。研究者也可以根据自己的设备情况对实验参数作一定的改动，也可以更多地利用速率--区带密度梯度离心或等密度离心来简化实验过程和提高分离纯度。
二）实验：
匀浆制备：
　　鼠肝12克加入0.25M蔗糖与5mM Tris-HCL (PH7.4)共45ml用"概论"中建议的匀浆设备与方法制备成匀浆待用。
鼠肝匀浆的差分分离程序
该实验流程中
沉Ⅰ：细胞核、质膜大片断，重线粒体，少量未破碎细胞及极少量沉Ⅱ→沉Ⅳ的成份
沉Ⅱ：重线粒体、质膜片断，及少量沉Ⅲ→沉Ⅳ成份。
沉Ⅲ：线粒体、溶酶体，高尔基膜，部分粗内质纲及极少量沉Ⅳ成份
沉Ⅳ：所有的细膜质可溶部份。
离心Ⅰ：低速冷凝冻离心机，50ml管。离Ⅱ，离Ⅲ为高速冷冻离心机8×50ml角转头。
离Ⅳ为超速机或高速机8×50ml角转头。
　　ii)从沉Ⅱ中纯化线粒体：
　　匀浆保持在200mM甘露醇，50mM蔗糖，1mM EDTA， 10mM Hepes-Naoh (PH7.4)中，全部操作均应使匀浆在冰溶中，产生沉Ⅱ后去除上清表面以及离心管壁部的脂肪（这一点很重要）
　　加20ml保持液到沉Ⅱ中稀释到30ml，3000g×10分再次离心并重复以上过程二次以上，Z后的沉淀保持在10ML保持液中。
　　iii)从沉Ⅳ中部份纯化光滑微粒体：
　　保持液为0.25M蔗糖，5mM Tris-Hcl (PH7.4)沉淀中光滑微粒体成松软状态位于紧密状态的粗糙微粒体沉淀之上。
小心地倒掉上清Ⅳ后，在沉Ⅳ中加入2~3ml保持液，轻摇，大部份光滑微粒体（沉ⅣA）将分散到清液中，而沉Ⅳ（B）（粗糙微粒体，紧密沉淀）仍在沉降中，倒出沉Ⅳ（A），余下的沉Ⅳ B加入2~3ml保持液即完成。
　　iii)从沉Ⅰ中部份纯化质膜：
　　保持液用 1mM NaHCO3
　　鼠肝加25ml保持液在研钵中锺击15次，仍用1mMNaCHO3稀释在100ml，搅拌2分钟并用孔径力75μm的尼龙布过滤。然后离心得到Ⅰ加5ml 1mM NaHCO3到沉Ⅰ中再放入匀浆器，慢速往复2~3次。再用1mM NaHCO3稀释到15ml，用甩平转头10ml玻璃锥形管，1200g离心10分钟，不用制动减速到停车，沉淀很明显由三层组成。轻轻摇动或搅动即可使Z上层的线粒体溶入上清液。中间层富含质膜，Z下层是细胞核。倒去上清加5ml1mM NaHCO3轻摇使中间层进入溶液，注意要尽可能少地扰动Z下层核沉淀。将再次倒出的上清液稀释到15ml并重复以上离心过程即可进一步纯化质膜。
　　iv)从上Ⅲ中分离粗糙和光滑微粒体：
　　从已经去掉线粒体的上Ⅲ中可以比从沉Ⅳ中更有效地分离粗糙及光滑微粒体，配置溶液
　　0.6M蔗糖，5mM Tris-HCL， (PH8.0)
　　15mM CSCL， 1.3M蔗糖，0.25M蔗糖
　　用角式转头，10~13ml厚壁PC（聚碳酸脂）离心管，先注入3ml 1.3M蔗糖-5mM Tris-HCL再注入1.5ml 0.6M蔗糖-5mM Tris-HCL从而形成了一个在离心管下部的阶梯形密度梯度。在梯度上部注入上Ⅲ直至充满离心管。100000g×90分钟。离心后得到二个主要部份：在0.6M蔗糖界面处或稍下一点是光滑微粒体，沉淀是粗糙微粒体。
　　要针筒吸出光滑微粒体。沉淀用三倍空积的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀释后再次离心160000g×30分，得到粗糙微粒体沉淀，再用2-3ml的0.25M蔗糖与5mM Tris-HCL(PH8.0)稀释即可。
　　V）从匀浆中纯化细胞核：
　　配制溶液：0.25M蔗糖在TKM（0.05M Tris-HCL，PH7.5）中及2.3M蔗糖在TKM中，25mM KCL， 5mM Mgcl2
　　将鼠肝放在研钵中加0.25M蔗糖-TKM，冲研10~15二次，用纱布过滤后加入二倍容积的2.3M-TKM，这样就使蔗糖的浓度为1.62M（该浓度Z好用光折射仪检测确认，20℃时折射率约为1.4115， 5℃时，1.4137）。
　　将此溶液9ml注入PC离心管，在溶液下属注入3~4ml 2.3M蔗糖-TKM。 130000g×30分，5℃，甩平转头。
　　离心后倒去上清液即为核沉淀。它可以根据研究者需要用合适的缓冲剂稀释。
　　vi)从沉Ⅰ中纯化细胞核：
　　取沉Ⅰ，用旋涡混合器分散沉淀并加入等睇容积的60%（W/W）蔗糖--TKM，放入匀浆器上下抽动2~3次，继续加入60%（W/W）蔗糖-TKM直至蔗糖浓度达到56%（W/W），用折射仪检测（5℃折射率1.4356，20℃时，1.4328）。取该溶液9ml移入14ml聚碳酸脂（PC）离心管管下部铺3~4ml60%(W/W)蔗糖液，在甩平转头中120000g 5℃离心30分钟，倒去上清液。余下的核沉淀可用合适的缓冲液稀释。为了消除沉淀中的膜，在制备匀浆时可用0.5% Triton x-100清洗。这种做法既消除了膜，又不影响核的结构。
　　vii)从沉Ⅰ中纯化质膜
　　配制溶液：60%（W/W）蔗糖液，37.2%(w/w)蔗糖液均分别加在5mM Tris-HCL(PH8.0)中将已制备好的沉Ⅰ乘余的缓冲液一起用温旋混合器混合后再加入60%（W/W）蔗糖使蔗糖终浓度为48%，并用折射仪检测（5℃，1.4181; 20℃， 1.4158）。取以上溶液6ml注入14ml PC离心管，上铺6ml 37.2%w/w蔗糖液以1m PH7.4缓冲液。在甩平转头中160000g， 5℃，离心3小时。
　　质膜聚集在37.2%w/w蔗糖液的上部，用注射器吸出，并用三倍容积的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀释后再在100000g， 5℃离心40分钟，沉淀即为质膜。
　　viii)从沉淀Ⅰ中纯化重体粒体
　　配制溶液：0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)， 1mM EDTA， 1mM Mgcl2，2.4M蔗糖，将沉Ⅰ用0.25M蔗糖，10mM Hepes-Naoh (PH7.5)，1mM Mgcl2稀释到15ml。要尽可能避免动及沉淀Z底部的红色部份。将已稀释部份倒出，混匀后加入23ml 2.4M蔗糖，10mMHepes-Na(OH)(PH7.5)，1mM Mgcl2。所得到的Z终蔗糖浓度力1.0M 。
　　用光折射仪测定（5℃，1.3827;20℃，1.3812）如需要，进行调节，将此液体倒入一个50ml PC管，上铺8ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-Naoh(PH7.5)在35000g， 5℃离心10分钟，倒去上清液重擦净沾在离心管壁上的物质。沉淀很清楚有二层，须离心管内壁加入10ml 0.25M蔗糖10mM Hepes-Naoh (PH7.5)， 1mM EDTA，轻轻晃动并稀释沉淀的上部褐色重线粒体层。
　　对于其他组织材料的线粒体纯化问题，请参照"Methods in Enzymology)第55卷。
　　Ⅸ）从沉Ⅲ中纯化溶酶体及粒体：
　　配制溶液：0.3M，1.1M，2.1M蔗糖分别溶入1mM EDTA与5mM Tris-HCL (PH7.0)在14mlPC管中制备好二个10ml，1.1M，2.1M蔗糖的线性梯度可以用梯度形成仪做成，也可以用不连续梯度(1.1M，1.4M，1.7M，2.1M，每种2.5ml)在5℃静量12~16小时也会形成连续的1.1~2.1M近线性梯度。
　　在沉Ⅲ中加入10ml，0.3M蔗糖液，轻摇，慢慢地可以看到离心管底部沉积了暗褐色的沉淀（溶酶体）倒去上清，加入4ml 0.3M蔗糖液在匀浆器中磨匀（注意：活塞与器壁要松一些）。取2ml以上匀浆置于线性梯度(1.1M~2.1M蔗糖)之上，轻搅匀浆使其与梯度液之间的界面尽可能减少密度的不连续，在甩平转头中95000g，5℃孙心4小时。
　　离心后，溶酶体区带形成于1.20~1.26 g/cm3密度之间（在离心管下部）而线粒体则形成于1.17~1.21g/cm3密度之间（在离心管中部。溶酶体区带中密度较高的部份相对较纯。
　　用光折射仪测定（5℃，1.3827;20℃ 1.3812）如需要进行调节，将此液体例入一个50ml PC管，上铺8ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)在35000g，5℃离心10分钟，倒去上清液重擦净沾在离心管壁上的物质。沉淀很清楚有二层，顺离心管内壁加入10ml 0.25M蔗糖10mM Hepes-NaOH (PH7.5) 1mM EDTA，轻轻晃动并稀释沉淀的上部褐色重线粒体层。
　　对于其他组织材料的线粒体纯化问题，请参照"Methods in Enzymology)第55卷。
　　Ⅸ）从沉Ⅲ中纯化溶酶体及线粒体：
　　配制溶液：0.3M，1.1M，2.1M蔗糖分别溶入1Mm edta与5mM Tris-HCL(PH7.0)
　　在14ml PC管中制备好二个10ml， 1.1M，2.1M蔗糖的线性梯度可以用梯度形成仪做成，也可以用不连续梯度(1.1M，1.4M，1.7M，2.1M，每种2.5ml)在5℃静置12~16小时也会形成连续的1.1~2.1M近线性梯度。
　　在沉Ⅲ中加入10ml，0.3M蔗糖液，轻摇，慢慢地可以看到离心管底部沉积了暗褐色的沉淀（溶酶体）倒去上清，加入4ml 0.3M蔗糖液在匀浆器中磨匀（注意：活塞与器壁要松一些）。取2ml以上匀浆置于线性梯度(1.1M~2.1M蔗糖)之上，轻搅匀浆使其与梯度液之间的界面尽可能减少密度的不连续，在甩平转头中95000g，5℃离心4小时。
　　离心后，溶酶体区带形成于1.20~1.26 g/cm3密度之间（在离心管下部）而线粒体则形成于1.17~1.21g/cm3密度之间（在离心管中部。溶酶体区带中密度较高的部份相对较纯。
　　Ⅹ）从沉Ⅱ及沉Ⅲ中纯化高尔基膜：
　　配置梯度溶液：38.79，36%，33%，29%(w/w)蔗糖液每种均加入5mM Tris-HCL(PH8.0)
　　用上清Ⅰ离心，10000g，5℃ 20分钟待到沉Ⅱ+沉Ⅲ
　　用5ml 0.25M蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)稀释沉淀，恒湿搅拌并使溶液的蔗糖浓度上升到43.07%(w/w)，用光折射仪检测（5℃，1.1979;20℃，1.1957）
　　在PC离心管中(13ml)由下往上依次铺设如下层次：
　　3ml样品（蔗糖浓度43%w/w），4ml 38.7%蔗糖液，2ml 36%蔗糖液，2ml 37%蔗糖液，2ml，29%蔗糖液。在甩平转头中160000g，5℃离心1小时，用注射器收集含有高尔基膜的上部二个区带。
　　我们也可以用这个方法从全匀浆中来分离纯化高尔基膜，匀浆中蔗糖浓度配到43.7%，然后用以上不连续梯度来分离纯化，但是大于大容量匀浆，直接法是不合适的。
　　小结：以上典型实验(1)鼠肝匀浆为原料，以差分离心为主，辅以蔗糖的连续或不连续梯度分离各种亚细胞器，方法简单易行，或本也较低。我们也可以用Ficoll，percoll， Metrizamide，Nycodenz，……等等梯度材料来分离纯化亚细胞器。
参考文献：
（i）J. Graham "I solation of subcellular organelles and Membranes" IRL press. 1984
(ii)W.H.Evans "I solation and characterizationof membranes and cell organelles"Oxford University press.
(iii)G.J.Wagner Methods Enzymol， 148，55，1987
(iv)Rickwood. D等Anal， Biochem， 187，318，1990
(v)余兴明"离心技术"设备与方法1993

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