多酚氧化酶邻苯三酚比色法(追加)

实验二十六 植物体内多酚氧化酶活性的测定
一、目的
通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下：

多酚氧化酶
邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌 ＋ H2O

三、材料、仪器及试剂
1. 材料：马铃薯块茎等
2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol•L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol•L－1儿茶酚；
20％三。
四、实验步骤
1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol•L－1pH6.5磷酸缓冲液，磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol•L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol•L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol•L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A•min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间 测定时酶液用量（ml）
A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A•g－1Fw•min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间 测定时酶液用量（ml）

公式中：A — 为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。