Z早解析肌红蛋白精细结构的方法

肌红蛋白是目前人类研究Z多的蛋白质之一。曾有报道发现当将马心肌红蛋白表面44位氨基酸从天冬氨酸突变为赖氨酸后，突变肌红蛋白与细胞色素b5之间的电子转移速率提高了一个数量级，但这一蛋白表面氨基酸对马心肌红蛋白结构稳定性及功能的影响未见报道。

为了进一步了解肌红蛋白Mb表面44位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能的影响，本论文以野生肌红蛋白表达质粒pGYM为模板，设计特异突变引物，通过PCR定点突变的方法将肌红蛋白(Mb)基因上的第44位酸性氨基酸天冬氨酸(D)的密码子GAT变成碱性氨基酸赖氨酸(K)的密码子AAA，获得肌红蛋白突变体D44K的基因。将带有突变体的目的基因克隆在肌红蛋白表达质粒pGYM上，经热激转化大肠杆菌BL21，大肠杆菌发酵使突变蛋白D44K大量表达、收集菌体。酶法裂解细菌，依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白，其纯度可达96﹪。用圆二色谱和紫外可见光谱分别研究野生型肌红蛋白及突变体(D44K)的耐热、耐酸及盐酸胍诱导的变性过程，实验结果表明：用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp44残基，增强了肌红蛋白耐热、耐酸变性能力，导致蛋白质的热变性中点温度Tm由71.9℃提高到75.1℃、酸变性中点(pH)1/2从3.95降到3.88，但在盐酸胍溶液中，突变体易变性，其变性中点浓度Cm从1.88mM降为1.75mM。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb(WT)和Mb(D44K)的过氧化物酶活性，实验结果表明：以愈创木酚为底物时，Mb(D44K)的Km为1.9mM而Mb(WT)的Km为3.3mM。Mb(WT)和Mb(D44K)过氧化物酶的Z适温度均为50℃，在相同温度下，Mb(D44K)的过氧化物酶活性高于Mb(WT)，且其过氧化物酶的热稳定性高于Mb(WT)。同时实验结果表明：Mb(D44K)过氧化物酶的Z适pH为5.0，且在宽的pH范围内仍保持高过氧化物酶活性，而Mb(WT)过氧化物酶的Z适pH5.5，在相同pH下，Mb(D44K)过氧化物酶对酸碱的稳定性高于Mb(WT)，且两者在碱性溶液中其酶活性受到YZ。