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运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后，完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞，体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析，并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。Z后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。
实验材料雄性新西兰白兔
试剂、试剂盒DMEMⅡ型胶原酶α-平滑肌肌动蛋白抗体胎牛血清胰蛋白酶D-Hanks’液
仪器、耗材饭盒眼科直剪眼科弯剪眼科直镊眼科弯镊玻璃培养皿广口瓶烧杯锥形瓶离心管磁力搅拌器搅拌子目尼龙筛网针式滤器
实验步骤一、实验方法
1.膀胱平滑肌细胞酶法分离
（1）肌注盐的200mg及氟哌利多5mg麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。
（2）超净台内依次庆大霉素溶液(浓度为100单位/毫升)、生理盐水及D-Hanks’液中浸泡洗涤5分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。
（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型胶原酶(2mg/mL)溶液40过一夜消化(约10-12小时)。
（4）然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。
（5）用100目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心(1000转/分，离心半径13cm)5分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50mL/LCO2、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养，培养液每周更换2-3次。
2.传代培养
（1）待培养的细胞通过增殖达到约80%汇合状态时做传代处理。
（2）弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有YZ作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。
（3）加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO2培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。
（4）用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。
（5）细胞进行计数后，按照1X105~106细胞/mL密度将细胞接种于培养瓶中。
3.培养细胞的观察及鉴定
采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE染色观察细胞形态，电镜检查，免疫组化染色检测α-SMA。
二、结果
两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。
均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。
本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。
倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构(图1中对照组2周的细胞；图2中实验组培养2周的细胞)。
细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型(见图3)。
电镜检查可见平滑肌细胞密班结构(图4)。
免疫组化染色检测α-SMA呈阳性反应(图5)。
从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-SMA呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。
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