GX液相色谱法测定饲料中B1

深度解析

丁　平　侯亚莉　程晓伟　重庆市饲料兽药监察所

　　是黄曲霉与寄生霉素产生毒株的代谢产物,它是化学结构相似的一类化合物,根据其结构的差异分别被称为B1、B2、G1和G2等,其中以B1Z为常见,也是已知Z强的化学致癌物之一,对粮油食品的污染较为严重。饲料检测
中常以B1为指标,我国的饲料限量标准通常为10～50μg/kg。国内外有关B1的检测方法主要有:薄层色谱法、酶联免疫测定法、GX液相色谱法和荧光光度法。试验采用了免疫亲和柱对饲料中B1进行净化,对GX液相色谱荧光检测方法进行了研究,为监控饲料中B1提供了简便可行的方法。
1　材料与方法
1.1　仪器和试剂
仪器　Angilent1100GX液相色谱仪,2475多波长荧光检测器,METTLERAE240电子天平,振荡器,涡旋混合仪,微孔虑膜（0.45μm）,玻纤滤纸,免疫亲和色谱柱（北京安易世纪贸易有限公司提供）。
试剂　B1标准溶液（1mg/L）,由Sig2ma公司提供,三氟乙酸,甲醇（色谱纯）,水为超纯水。

1.2　溶液的配制
1.2.1　样品提取液取550mL甲醇,用水定容至1000mL,混匀。
1.2.2　流动相取450mL甲醇,用水定容至1000mL,混匀。
1.2.3　B1衍生标样的配制分别准确吸取一定量的标准准备液,置于5mL玻璃试管中,在50℃水浴锅N2流下吹干,加300μL的衍生化试剂三氟乙酸进行衍生,在室温下放置3min。在50℃水浴锅N2流下吹干,用1mL甲醇、乙腈和水等体积混合的溶液溶解,配置成浓度为1、
2、5、10和20μg/L的标准溶液,分别进行HPLC检测。
1.3　样品的处理
准确称取样品5.0g,置于150mL具塞锥形瓶中,加入1.0g氯化钠和40.0mL样品提取液,往复振荡30min,用玻纤滤纸过滤。准确移取10.0mL滤液并加入30.0mL水稀释,注入已用水平衡至室温的IAC小柱,用3mL水淋洗,用3mL甲醇洗脱,收集洗液置玻璃试管中,在50℃水浴锅N2流下吹干。按标准品衍生方法处理后进行HPLC检测。
1.4　回收率的测定
称取空白饲料5.0g,置于150mL具塞锥形瓶中,分别加入标准工作溶液,使样品中药物浓度分别为20.0、10.0和2.0μg/kg,混匀后静置10min,每个浓度水平设4个平行,按1.3的方法分别处理和测定。
1.5　色谱条件
色谱柱　C18柱,250mm×4.6mm,粒径5μm;柱温25℃;流动相450mL甲醇+550mL水;激发波长365nm;发射波长435nm;进样量25μL。
2　结果与分析
2.1　测定方法的线性响应
取配置好的标准溶液在选定的色谱条件下进行测定,绘制标准曲线（见图1）。在浓度为1～50μg/L时拖尾峰（tai领peak）。前者少见。>色谱峰面积与浓度呈线性相关,其回归方程为y=2.5241x+0.2722,相关系数r2=0.9998。其线性响应范围完全满足测定的要求,表明该方法定量测定可靠。

2.2　测定方法的灵敏度
在试验条件下,按信噪比（S/N）为3计算,求得饲料中B1的检测限为0.01μg/kg,按S/N为10计算,求得饲料中B1的定量限为0.03μg/kg,满足定量分析的要求。
2.3　添加回收率试验
添加回收率及结果的变异系数见表1。标准品、空白饲料样品及添加标准品的饲料样品的色谱图见图2,本方法条件下B1的保留时间约为8.3min。
从表1可以看出,在3个饲料添加水平下,B1的平均回收率为74.9%～81.6%,变异系数为0.01%～0.04%。

3　讨论
本方法采用甲醇-水提取饲料样品,通过IAC柱净化浓缩,以HPLC荧光检测法测定B1的含量。从空白饲料样品的色谱图和添加饲料样品的色谱图可以看出,B1色谱峰附近没有杂质峰,说明饲料中的杂质对本测定方法没有干扰。
从表1看出,HPLC法有较高的回收率（平均77.5%）和良好的重现性（平均变异系数0.03%）。由于的毒性很大,现在对的限量要求达到2～4μg/kg以下甚至更低。对含量的限量越低,表明对检测仪器和方法的要求越高。复杂的操作、大量的有机试剂、严格的防护条件及对操作者的损害等都不适合形势发展的要求。试验用免疫亲和色谱-HPLC法代替了常用的薄层法,减少了操作步骤和有机溶剂的损耗。国标食品中的测定采用柱后衍生化HPLC-荧光光度法,试验采用了这一方法,对仪器的要求降低了。
试验研究了进样体积对B1峰型的影响,当进样量为100μL时,样品峰的峰型很不对称,有前延峰。后改用50μL的进样量时,峰型得到很大的改变,也很对称。由于25μL进样时也能满足定量的要求,试验Z后确定进样量为25μL。在样品提取时,振荡的时间应足够,刚开始试验时,提取时间是15min,回收率很低,不能满足定量的要求。当振荡时间延长为30min时,回收率得到较大的提高,能满足饲料检测的要求。
试验结果表明,免疫亲和色谱HPLC法操作简便易行,能满足分析的要求,是测定饲料中B1的一种灵敏且可靠的方法。

参考文献
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2004-08-26