GX液相色谱测定肉制食品中五种邻苯二甲酸酯

GX液相色谱测定肉制食品中五种邻苯二甲酸酯
摘要:建立了肉制食品中5种邻苯二甲酸酯类增塑剂(PAEs)含量的检测方法。样品用正己烷提取，C18柱分离，柱温35.0℃，乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，紫外检测波长226nm。5种PAEs分离特异性好，在0.02~10μg/mL之间均具有较好的线性关系，检出限在4.4~13.8ng/mL之间，高、中、低3水平的回收率均在79.5%~102.0%之间，相对标准偏差均在1.1%~14%之间。方法适用于肉制食品中邻苯二甲酸酯类的检测。


关键词：邻苯二甲酸酯；GX液相色谱；肉制食品
 
食品容器和包装材料增塑剂包括邻苯二甲酸酯类(PAEs)、己二酸酯类(AEs)等。增塑剂与塑料间并没有严密的化学结合键，故很容易进入环境。近年的研究表明：PAEs和AEs在体内长期累积，可致畸、致癌和致突变[1,2]。因此，增塑剂的分析检测受到重视，尤以PAEs为研究对象居多。目前，PAEs的检测技术主要采用薄层色谱法[3]、气相色谱法[4~6]、液相色谱法[7~14]、气-质联用法[15,16],样品处理技术主要有液-液萃取[3,8,14,15]、固相萃取[4,5,9,11,16]以及固相微萃取[6,7,12,15]等,涉及的基体主要为PVC塑料[3,4,6,15]、环境样品(如水、泥土)[5,8,13,16]、组织和血浆[7,8,10,15]、食品[12,14]等。食品因直接被摄入而危害更大，报道过的研究对象主要包括：水产品、牛奶、食用油等。肉制食品的脂肪含量高，PAEs在其中的溶出程度尤为严重，但至今未见相关检测方法报道。
   本文以邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸正二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)等5种PAEs为研究对象,建立了GX液相色谱法测定肉制食品中PAEs的方法。方法重现性好，准确度高，可用于肉制食品中此类物质的测定，也可用于生产企业的质量控制。

1  实验部分
1.1  仪器与试剂
   戴安P680CGX液相色谱仪，包括：P680型四元梯度泵，TCC-100型柱温箱，ASI-100型自动进样器，UVD170U型紫外检测器，Chromeleon色谱工作站；AB104-N型电子天平；XHF-D型高速分散器；SK-1型涡旋混匀器；DS180A型超声波清洗机；HeraeusPrimo R高速冷冻离心机；D10-12型氮气吹扫仪；Heal ForcePW超纯水系统。DEP、DBP、DEHP、DOP标准品(Sigma-Aldrich)，BBP标准品(TCI)，乙腈(HPLC级)、正己烷(Fisher)，水为超纯水。

1.2  色谱条件
    色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；预柱：PhenomenexC18柱(4mm×3mm，5μm)；紫外检测波长；226nm；柱温:35.0℃；进样体积20μL；流动相：乙腈-水；流速：1.0mL/min；梯度洗脱，步骤如下表1所示。



 
1.3  标准溶液配制
分别称取DEP、BBP、DBP、DEHP、DOP标准品各0·0500g，分别用乙腈定容于50mL容量瓶中，配成1mg/mL的5种PAEs的储备液。准确移取5种PAEs的储备液各100.0μL，置于同一10mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=75∶25的混合溶液定容,配成10.0μg/mL的混合标准应用溶液。再用水逐级稀释，配成2.0、1.0、0.20、0.10、0.020、0.010μg/mL的混合标准应用溶液。
1.4  样品处理
   准确称取已切碎的火腿肠0.5g于试管中，加入正己烷2mL，匀浆，涡旋振摇3min，超声提取15min，在-10℃下10000r/min离心10min，取清液；同法再萃取1次，合并2次清液，45℃下氮气流吹干，用乙腈0.5mL溶解残渣，经0.45μm微孔滤膜过滤后，进样。以生产日期不超过15天，距离表面1cm以上的内层肉制品作为空白。

2  结果与讨论
2.1  色谱条件的选择
   PAEs在205、226和272nm处有3个特征吸收峰，吸收强度依次增大，但272nm处杂峰干扰较多，综合考虑吸收强度及干扰因素，选择226nm作为检测波长。
   以纯乙腈作为流动相时，BBP和DBP、DEHP和DOP两两未能达到完全分离，增加流动相中水的含量，5种PAEs能完全分离，但DEHP和DOP 的出峰时间增长，当以V(乙腈)∶V(水)=75∶25的流动相等度洗脱时，DOP的出峰时间超过了50min，故考虑采用梯度洗脱。在如表1所示条件下5种PAEs完全分离，出峰时间控制在22min之内。

2.2  样品处理条件的选择
   肉制食品所含成分复杂，目前主要采用有机溶剂液相萃取。尝试采用乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等溶剂，正己烷效果*好。因肉制食品含有大量油脂，在萃取PAEs过程中油脂易被正己烷同时提取，对样品测试产生干扰。考虑DEP、BBP、DBP、DEHP、DOP的凝固点分别为：-40℃、-35℃、-35℃、-55℃、-25℃，而大部分油 脂尤其是肉制食品中的主要油脂动物脂肪，在-8℃以上即发生凝固，故在-10℃下高速冷冻离心，可除去大部分油脂，减少干扰[14]。

2.3  特异性
   图1给出了一系列具有代表性的色谱图。图1(a)是空白肉制食品的色谱图，可见尽管有生物杂质的特征峰，但均不在5种PAEs出峰时间段，,对分析物不产生干扰；图1(b)为5种PAEs的标准谱图，浓度均为10.0μg/mL。DEP、BBP、DBP、

DEHP、DOP的保留时间分别是4.605±0.005、7.968±0.005、8.730±0.007、20.166±0.012和21.078±0.007min；图1(c)为加标模拟样的色谱图，在图中5种PAEs的特征峰能够轻易准确地识别；图1(d)为一个出厂3个月的实际肉制食品的 色谱图，其中检出有DOP，含量为23.2ng/g。

2.4  回归方程及检出限
   取1.4所述的标准系列溶液，在选定的色谱条件下，依次进样，记录色谱图，每个浓度重复进样3次。分别以每种物质的平均峰面积(y，mAU·min)对质量浓度(ρ，μg/mL)作图，得回归方程及检测限如表2所示。线性相关系数在0.9999~1.0000之间，表明5种PAEs在0.01~10μg/mL范围内线性良好。在该条件下，基线噪声为0·01mAU，以3倍信噪比(S/N)计算检出限，结果如表2。


2.5  回收率与精密度
   取0·5g火腿肠3份，各加入10、1、0.1μg/mL的混合标准溶液0.1mL，即得添加量分别为1、0.1、0.01μg的加标模拟样，按照1.5进行样品处理，每个加标模拟样重复测定5次，计算回收率和精密度，结果如表3所示，5种PAEs的高、中、低3水平的回收率均在79.5%~102.0%之间，相对标准偏差均在1.1%~14%之间，表明该方法具有较好的回收率与精密度。其中DOP的回收率稍微偏低，原因可能是其凝固点相对较高，在冷冻离心过程中损失相对较大。

2.6  样品分析
   选取同一厂家、同一批次的肉制食品火腿肠，采用本方法分析，测定5种PAEs含量，以生产日期不超过15天,距离表面1cm以上的内层肉制品作为空白,结果如图1(a)。另测定距生产日期恰3个月时的样品，结果如图1(d)，检出其中有DOP，含量是23.2ng/g，该含量为将样品整体粉碎而得，实际上，初步实验结果表明，紧贴塑料的表层肉制食品中PAEs含量远高于内层，具体迁移规律正在深入研究中。