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Q:4-硝基苯糖苷酶底物如何应用于比色法测定酶活性？
A:酶溶液稀释:将酶制剂稀释到适当的分析缓冲液中(100mM0.1mg/mL牛血清白蛋白，在酶经检测Z佳pH范围内)。初始的1:100稀释液置于一个100mL容量瓶中，随后加入10倍的稀释液以获得合适的酶溶液浓度。40摄氏度下，水浴加热酶稀释液5分钟进行预培养。
加底物:0.2mLpNP底物(10mM)分别加入8个玻璃试管中(4个时间点的重复样本)，40摄氏度水浴培养5分钟。
酶反应:0.2mL酶(按步骤4.23制备)分别加入含有底物的玻璃试管中，涡旋混合，并在40度水浴中培养重复样本3，6，9，和12分钟。在培养接近终点时，加入3.0mL2%磷酸三钠溶液以终止反应，并立即快速涡旋混合。
反应空白样:将3.0mL2%磷酸三钠加入2个玻璃试管中，然后加入0.2mLpNP-底物(10mM)并涡旋混合，接着分别加入0.2mL酶到2个试管中并立即涡旋混合。在室温下培养。
在400nm下检测所有样品的吸光度
用水为分光光度计归零。
检测两个空白样(记录数值，然后根据其一将分光光度计归零设定这两个值很接近).
检测其余样品的吸光度
根据吸光度和培养时间绘制吸光度曲线，并将结果用于计算。
计算:
1个单位酶活性，是每分钟在Z佳pH和40摄氏度下将1微摩尔PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的数量。
按以下公式进行计算:
U/mL=(A400/按分钟计的反应时间)x(按毫升计的总反应体积/按毫升计的酶溶液体积)x(1/pNP的消光系数)x酶稀释因子
U/mL=(A400/分钟)x(3.4mL/0.2mL)x(1/18.1)x稀释因子
在这里:
A400/min=吸光值(反应)/分钟吸光值(空白)/分钟.
培养时间=10min.
细胞总体积=3.4mL
分析的等分体积=0.2mL
2%磷酸三钠中pNP的消光系数=18.1
该计算设定,在记录吸光度变化的整个10分钟反应期内，反应速率呈线性分布。如果实际情况并非如此，则使用Zgao反应速率来替代2-10分钟时间内记录的速率
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