微生物学的相关检测知识

微生物学检测知识
一.异氧细菌的测定
1. 水样的准备：
1.1 检验之前，在每个培养皿上表明水样号码、稀释度、日期和其它任何应有的说明。每个稀释度至少准备两个重复的培养皿。
1.2 将水样彻底的搅动均匀，方法是上下（左右）摇动25次。摇动的幅度大约0.3米，所花时间为7秒钟。
2. 稀释水和培养基
2.1稀释水：将8.5克氯化钠在1升蒸馏水中。分装的量以蒸压灭菌15分钟之后能维持99±2.0毫升或9±0.2毫升为度。
2.2缓冲水：配置磷酸盐缓冲储备液，是将34.0克的磷酸二氢家钾溶液在500毫升的蒸馏水中，用1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节到7.2±0.5，然后再加蒸馏水到1升。把1.25毫升的磷酸盐缓冲储备液和50毫升的氯化镁溶液（38克氯化镁/升蒸馏水）加蒸馏水到1升，分装到瓶子或试管里，分装的量以蒸馏水之后能维持99±2.0毫升或9±0.2毫升为度。
2.3在任何稀释水中制备细菌悬浮液后，不要在室温下待留30分钟以上，因为细菌的死亡或繁殖都可能发生。
2.4营养琼脂培养基
蛋白胨10.0克
牛肉膏3.0克
氯化钠5.0克
琼脂  15.0克
蒸馏水 1升 
以蒸压（121℃）灭菌15分钟，PH在7.4到7.6之间。注配置后的澄清度有无沉淀、PH变化、细菌的发育，对异常者不能使用
3. 水样的稀释和量取
3.1选择稀释度：以期在平皿上的菌落总数介于30和300之间
3.2水样的稀释：用1毫升灭菌吸管吸取水样1毫升注入到99毫升的空白稀释水中。当吸取水样时，不要把吸管尖插入液面之下2.5厘米深。放出水样时，吸管尖不要触及稀释水。振摇稀释瓶混合均匀，作成1：100的均匀稀释水样
3.3另取一支1毫升灭菌吸管，吸取1：100的均匀稀释水样，做100倍递增稀释到1：1000的均匀稀释水样
3.4稀释水样的量取
  每从一个不同的稀释水样做转移、接种时，要各用一支不同的无菌细管。当放出一定量的水样时，握住吸管与培养皿底成450的角度相接，皿盖要适当提起，使吸管恰足以插入，容许2-4秒的时间，让液面从吸管上的1好升的刻度线排出到吸管尖。
将吸取的1毫升水样转移到无菌培养皿中后，加入融化的培养基。
4. 平皿的操作
4.1融化培养基：把盛放无菌的固态琼脂培养基的容器放在沸水中，使培养基融化。若发现融化的培养基中含有沉淀物就应该弃去不用。不可对灌皿用的培养基再行蒸压灭菌。
  融化的培养基可置于45±1℃水浴中保温，到使用之前才取出。
4.2灌皿：从diyi个水样的稀释开始到对Z后一个平皿施以灌皿，时间不得超过20分钟（以10分钟为Z好），稀释水样转到平皿后，应及时将凉至45±1℃营养琼脂培养基灌入平皿至少10-12毫升，灌皿之后将融化的培养基和其中定量的试验水样彻底混合。方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转，不要使混合液溅到培养皿的边缘，让平皿培养基于水平位置静止10分钟左右固化。固化之后，倒置平皿，在培养箱中进行培养。
4.3无菌控制：将培养基灌入加有1毫升稀释水的无菌平皿内作空白对照，检查培养基和稀释水的无菌性。
5. 培养
5.1在培养箱中叠放平皿，不可使平皿过于拥挤
5.2一般水样的标准平皿记数应在35±0.5℃之下培养48±3小时
6. 记数和记录
6.1培养之后，取出平皿，立即数出皿中所有的菌落数。（如果记数暂缓施行，平皿存放在5—10℃且不超过24小时）
6.2在决定标准平皿记数的时候，应选择具有30-300个菌落的平皿
6.3如果平皿中的菌落数远超过300，不要在记录中写成“多不克记”
6.4对平皿上有蔓延菌落生长，应写上。
7. 记数结果的报告
7.1应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数
7.2若有两个稀释度，其生长的菌落数在30-300之间，则视二者之比来决定。比值小于2报告平均数，大于2报告其中较小的数字
7.3若所有稀释度平均菌落数大于300，，则按稀释度Zgao的平均菌落数乘以稀释倍数报告
7.4若所有稀释度平均菌落数小于30，，则按稀释度Zdi的平均菌落数乘以稀释倍数报告
7.5若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以Zdi稀释倍数报告
7.6若所有稀释度平均菌落数均不在30-300之间，，则以Z接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告
计算和报告；
标准平皿记数，是把同一稀释度两个重复的平皿所产生的菌落予以记数求得平均数之后，对社个数值四舍五入，修约成两位有效数字，再乘以所对应的稀释度的倒数而得来。
8. 误差
分析人员的平行试验误差维持在5%以下；在现行试验误差维持在10%以下
二铁细菌的测定
1. 培养基
(NH4)2SO4  0.5克
NaNO3  0.5克
K2HPO40.5克
CaCL2  0.2克
MgSO4.7H2O  0.5克
柠檬酸铁铵  10.0克
蒸馏水  1000毫升
PH调至6.6-6.8，分装15×150毫升试管，每管5毫升，蒸压（121℃）灭菌15分钟
2.培养：温度30±1℃，培养时间14天
3. 记数结果的报告
3.1观察培养后的试管，若棕色培养液变成无色透明液体，而下部有褐色或黑色沉淀，表明有铁细菌存在，为阳性
3.2若棕色培养液有明显的无色透明液体层出现，即使下部无沉淀，也表明有铁细菌存在，为阳性
3.3若培养液仍为棕色透明液体，或虽混浊但上部无明显无色透明液体层出现，表明无铁细菌存在，为阴性
结果与计算：
对上面阳性管数累加，求出数量指标，查表，并计算报出结果
三硫酸还原菌的测定
1. 水样的采集：使用事先消毒的小口瓶，将水样充满以排除氧气
2. 培养基
乳酸菌 3.5克
酵母菌 1.0克
MgSO4.7H2O  2.0克
硫酸钠 0.5克
K2HPO40.5克
CaCL2.2H2O  0.2克
硫酸亚铁铵0.3克
维生素C  0.10克
蒸馏水1000毫升
先将硫酸亚铁铵与维生素C除外,配制培养基基本料,分装在250毫升的三角烧瓶中,每瓶注入200毫升.瓶塞及颈部用纸包裹, 蒸压（121℃）灭菌15分钟,灭菌后的PH值为7.2±0.3
使用的当天,分别配制硫酸亚铁铵  溶液(3克/100毫升)和维生素C溶液(1.00克/100毫升),以0.45微米孔隙的滤膜CJ,或用紫外线灭菌.然后分别以无菌的操作技术将二者各加1毫升100毫升的培养基基本料中。此培养基出现混浊或少量沉淀不影响沉淀结果。
3. 稀释与接种
3.1将选取的几个稀释度的水样分别接种于已灭菌的空试管中，每管接踵1毫升，每稀释度重复接种4管。接种一个稀释度更换一次吸管
3.2将培养基轻轻摇均，注满满已接踵的试管，然后加金属盖与液面间不得留有空隙
3.3若培养基非当天配制，应先在沸水中加热10分钟左右，以驱除溶解氧，再冷却后使用
4. 培养：温度30±1℃，培养时间14天
5.记数结果的报告
5.1观察经培养后的试管，如有黑色显现，表明该管中有硫酸还原菌存在，为阳性。若无黑色显现，表明该管中无硫酸还原菌存在，则为阴性
5.2根据测定方法求得数量指标，查比，计算并报告结果