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纤维素酶活力测定实验原理
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有Zda光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
1实验方法
1．1试验药品、设备
纤维素酶（DH一8405，DM一8637，德美化工），DNS试剂，冰醋酸，醋酸钠，葡萄糖（分析纯），滤纸（定性），羧甲基纤维素酶CMC（试剂级），纯棉针织半漂布SPECT0RPH0T0METERVIS一723型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；HB一4CF型高温试色机（XIAMENRAPIDCO．，LTD）。
1．2试验方法
1．2．1酶活力测定方法
本实验中酶活力的定义为1gN体酶f或1rnl液体酶），在50度，pH=4．5条件下，1h水解底物产生相当于1mg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位．以u／g表示。
取适当酶液．分别以滤纸或CMC溶液为底物．于50℃恒温水解反应．然后加入显色剂DNS．沸水浴煮沸，加入蒸馏水，在540nm测定吸光度值。
1．2．2纤维素酶应用工艺和效果评定
纤维素酶用量为1．5g／L，NN55℃，调节pH=4．5，浴比1：10，处理时间45min，得出减量率。将酶处理前后的试样在105℃烘箱中烘至恒重。
其中减量率=[处理前织物干重一处理后织物干重）／处理前织物干重]xl00％
2结果与讨论
2．1稀释倍数影响（滤纸法）
DH一8405、、DM一8637稀释倍数与酶活力的关系见表1、表2。
如以酶活力为y轴，以稀释倍数为X轴作图，所得曲线的拟合一元线性回归方程为y=1．1226x+3422，R2=0．9890。
同样好作酶活力（v）与稀释倍数（x）的关系曲线．其拟合一元线性回归方程为v=0．5023x+853．65，R2==0982。
由以上结果可知．稀释倍数的改变会明显改变酶活力测定的结果。在一定范围内稀释度大．酶活力结果偏高．稀释度小．结果偏低．但是稀释度过大．结果也有所降低：另外．参考各类纤维素酶活力测定方法．用不同稀释度的酶液对酶活力拟合一元线性回归方程．可看出该线性相关区域较窄．且对于不同的酶存在不同的线性关系．在此线性范围内．由任一稀释酶液得到的结果都可以推算得到酶液活力。当然这样给测试带来很多不便．平常测试中也可以规定吸光度的范围．如以吸光度值0．5左右酶活力定为100％．可看出在此值左右所测酶活力波动不大．相对较稳定。
2．2底物选择影晌
滤纸作为底物结构较为松散．可及区较多．是聚合度和结晶度都居中等的纤维性材料．容易同时被内切酶和外切酶降解．再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖，反映的是纤维素酶三类酶组分的协同作用的总酶活：另外由于外切酶对纤维素链的专一性高，而内切酶的专一性较低．在降解CMC时．主要反映的是内切酶的活力因此．酶对不同底物的活性是不同的．同一酶活测定方法获得的几种酶制剂的活力数值．在作用其它底物时仅能作为参考。本实验中选用了滤纸和CMC两种底物．对DH一8405、DM一8637NJ种酶进行活力测试，其结果如表3
由3表可知，以CMC为底物测得的酶活力值比以滤纸为底物测得的酶活值高，即两种酶的内切酶活力较高．且比总酶活还大，几乎差一个数量级。可能是由于CMC为水溶性底物，而滤纸与酶属多相催化，所以反应的空问阻碍较大．也说明了吸附对酶的活性部位与纤维素的结合及催化均有很大影响。
纤维素酶的3组分．每种酶对纤维素的作用部位都不同．相互之间有协同性，即使是单一的酶对不同底物的活性也是不同的．同一酶活测定方法获得的几种酶制剂的活力数值．在作用其它底物时仅能作为参考。
2.3酶活力与减量率关系
分别用DH一8405和DM一8637对白布进行食毛整理．得出平均减量率比值与酶活力之间关系．结果如表4所示。
表4可明显看出织物的减量率与内切酶活力关系密切。说明织物的酶减量率受内切酶活力影响较大。
3结论
（1）以滤纸为底物．用不同稀释度的酶液对酶活力拟合一元线性回归方程．可看出两者之间存在较窄的线性关系，在此线性范围内由任一稀释酶液得到的结果都可以推算得到酶液活力．但各种酶其线性关系是不同的，在实际中为测试方便也可规定吸光度的范围．减少酶活力测试误差。
（2）底物不同，活力的测定值也不同．以羧甲基纤维素为底物测得的CMC酶活值比以滤纸为底物测得的FPA酶活值高；说明酶对水溶性底物有较高的活力；另外根据酶食毛效果看．CMC酶活更接近实际应用效果。
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