荧光定量PCR的技术原理和化学方法

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

技术原理

混合模板DNA和有荧光素的Taqman探针，遵守聚合酶链反应规律使高温变性，低温复性，适温延伸的热循环完成，切断和模板DNA互补配对的Taqman探针，荧光素在反应体系中游离。荧光在特定光激发下发出，被扩增的目的基因片段随着循环次数的增加呈指数级增长，Ct值根据实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度求取出来，同时对照多个已知模板浓度的标准品，就能够使待测标本目的基因的拷贝数得出。

荧光化学分方法

实时荧光定量常用的荧光化学分为有Tag Man探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′ 端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针仅和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，Taq酶遇到探针，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长Zda约为 520 nm，Zda吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光大大增强，

荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。这个方法的优点是其能够对所有dsDNA 序列的扩增进行监测，有着比较简单的检测方法和比较低廉的成本，但是也正是因为荧光染料能够结合所有的dsDNA 。那么非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合，使荧光信号产生，导致实验结果假阳性，所以探针法的特异性要比该方法的特异性要更高。由于和目标产物相比较，非特异性产物和引物二聚体的变性温度要更加的低，因此，能够在可以在熔解曲线反应过程中，信号可以通过软件分析仪器来收集从而鉴别。