采用GC Orbitrap质谱仪对农药进行定量分析的常规方法

【概述】

食品国际贸易的长足发展使各种果蔬得以全年供应。不过，这也对努力确保食品供应链安全的食品安全监管机构提出了全新的挑战，特别是各地可能使用的数百种农药的安全问题。为此，欧盟制定了Z为严格的农残法规：2008年，欧盟颁布EC No. 396/20051法规，将尚未设置实质性Zda残留限量（MRL）的所有农药/商品组合的默认MRL设置为10μg/Kg；继此，2009年，农药安全审查EU 91/414/EEC2指令使约250种农药得以批准，并将所有其他农药的容许残留量设置为默认限值（10μg/Kg）；Z近，Zxin版“食品饲料中农残分析的质量控制和方法确认的指导文件SANTE/11945/2015”于2016年年初正式实施3。该指导文件介绍了方法验证和分析质量控制（AQC）的要求，以支持在农残官方控制框架内报告并用于Zda残留限量（MRLs）合规性检查、执法行动或消费者暴露评估的数据的有效性。该文件预期供欧洲官方控制实验室使用，而实际上被广泛用于世界各地的农药实验室。Z严格的要求的实施为致力于提供具有成本竞争优势的极ng确服务的检测实验室提出了巨大挑战。

农残测试通常要求使用结合三重四极杆质谱仪的液相和气相色谱技术进行检测。这些分析技术必须符合选择性监测的化合物范围和灵敏度的要求，但是于检测那些在数据采集时进行测量的目标农药，故需谨慎的方法优化和管理，以确保所选离子监测窗口可行。近年来，高分辨率Orbitrap质谱仪凭借其附加逐步添加逐步成为MS/MS技术的替代技术。4

使用高分辨率质谱仪（HRMS）时，默认采集模式为非靶向（全扫描）模式，便于管理和在单次进样中监测无限数量的农药。此外，全扫描数据分析还提供对定性识别点的补充（如质谱图检索）的访问，使样品的回顾性分析成为可能，以另行检索在数据采集时未予考虑的新兴农药或其他杂质。

在本研究中，按照 SANTE/11945/2015指导文件，在全扫描模式下，针对果蔬中 GC 可测农药的常规分析，对Thermo ScientificTM Exactive GC OrbitrapTM质谱仪的定量特性进行了评估。Exactive GC-MS系统提供高达 60,000 （m/z 200 时 FWHM） 的常规高质量分辨率和适合 GC 峰的扫描速度，促进复杂基质成分中痕量化合物的检测。

【实验/设备条件】

表1. GC条件。

表2.质谱仪条件

【实验/操作方法】

从当地超市购入西红柿、韭葱和橙子，按照柠檬酸盐缓冲体系的QuEChERS方法进行前处理，将10 mL乙腈加入10 g均质样品中，振荡4分钟。加入盐混合物，将离心管振荡4分钟，再以3700 rpm的速度离心5分钟。将上清液（5 mL）转移到内含硫酸镁和125 mg PSA的15 mL PTFE离心管中。在涡旋振荡器中振荡提取物，如上进行离心。Z终的乙腈提取物（1g/mL）用作空白基质。制备校准液系列时，取100μl乙腈空白基质在氮气流下干燥。在含有适当浓度农药的100μl乙酸乙酯中对样品进行复溶。

在西红柿、韭葱和橙子体系中，配制51种农药的三个校准液系列，浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200

和500μg/Kg。这51种农药涵盖了范围广泛的化学农药类别，使用这三种基质共产生153种农药/基质组合。评估化合物线性时，先分析与校准液系列匹配的基质，再对每种基质的10μg/Kg样品进行10次重复进样。评估一段时间内的可重复性，再将同一样品瓶中10μg/Kg的西红柿标样进样100次。

【实验结果/结论】

本研究旨在根据SANTE指令要求评估Exactive GC系统在三种不同样品基质中对农药进行常规分析的性能。所选样品

（西红柿、韭葱和橙子）呈现了常规测试中常见的简单和复杂基质。为加以说明，图1显示了不同样品复杂度的总离子色谱图（带固定Y轴）。韭葱基质显然是Z复杂的基质，需以高质量分辨率将目标分析物从化学噪声背景中提取出来。

针对常规农药筛查，HRMS处理软件需快速、准确且可根据不同的需求进行定制。TraceFinder可满足所有这些要求，并在5分钟内处理各批校准标样和10次复制样品。在TraceFinder中，结果以表格格式呈现给用户，并使用数据标记来快速识别阳性农药和所满足的标准。灵活的报告选项意味着数据可导出到其他软件或直接从TraceFinder进行结果的报告。

根据指导要求进行确认

该分析的一个目的是确定全部三种基质中所有农药的检出限（LOD）、确认限（LOI）、线性范围和峰面积重复性。尽管SANTE指导文件中并未讨论LOD，但由于依据定量离子得到的的检测限用于形成Z终的校准系列，并Z终用于确定样品中检测到农药的浓度，因此掌握定量离子的检出限十分有益。通过评估基质匹配校准系列和每种基质10μg/Kg水平的农药的重复进样评估LOD。LOD定义为农药主要定量离子的提取离子色谱图（XIC）中存在S/N（峰到峰）＞3的峰。LOI的确定应遵SANTE/11945/2015指导文件。为进行正确确认，应满足以下要求：

图1. Y轴固定于4.0 e9的西红柿、韭葱和橙子提取物的全扫描总离子色谱图（TIC），显示本研究中所用样品基质的复杂性。

(i)每种农药检出两种离子且质量极ng确度< 5 ppm，峰S/N > 3

(ii)保留时间容差±0.1 min（与同一序列的标准品相比）

(iii)离子比率在同一序列标准品的平均离子比率的±30%以内。

(iv)可选项：为使鉴定达到更高的置信度，可使用其它标准，如全扫描质谱、同位素模式匹配及其他碎片离子。

遵循监管标准（LOI）对所有浓度小于等于5μg/Kg（表3-5）的基质中除韭葱中百菌清以外的所有农药进行鉴定。百菌清因与韭葱基质中的硫化合物相互作用而发生损失。5153种农药/基质组合（79%）中的多数具有≤  2μg/Kg的确认限。图2为计算出的检出限汇总，图中显示93%的农药/基质组合的检出限≤ 1μg/Kg。多个鉴定点和远低于MRL的检出限增加了鉴定的置信度并降低了假阴性和假阳性的结果。将GX电子轰击电离（EI）与全扫描采集相结合能够用多定性

离子鉴定农药。

图2.农药/基质组合的检出限（LOD）和确认限（LOI）

Exactive GC系统生成标准的EI质谱图，重现性高，易于库检索（低分辨或高分辨率MS数据库），让基于质谱图检索进行的农药检测和鉴定更加方便。由于Orbitrap分析仪的质量极ng确度足够高，化学式可轻松的与碎片离子极ng确质量数吻合，故可快速添加此结果至化合物数据库中。

定量可靠

在0.5-500μg/Kg的浓度范围内，使用基质匹配标准品进行定量线性评估。在所有情况下，在三种基质中，从检出限到500μg/Kg，每种农药的相关系数（R2）均> 0.99。图3为TraceFinder浏览器显示的扑灭津实例。或受分析物吸附的影响，苯锈啶的浓度线性至200μg/Kg，属于个别例外。极ng确定量取决于多项因素，其中一项因素为采集速度，采集速度应足够快速，以能在色谱峰中提供至少12个点。Exactive GC系统的分辨率达60,000，扫描速度约7 Hz。图4为在6秒峰上有38个点的乙酯杀螨醇峰。

图3.显示鉴定结果呈阳性的农药、提取离子色谱图及校准图的TraceFinder浏览器（以扑灭津为例）。在校准范围内和10μg/kg重复样品样中sub-ppm的扑灭津的质量极ng确度。当超出规定时提示并标记鉴定标准信息。

表3.韭葱中农药的方法性能总结。*韭葱中降解的百菌清。

图4.在分辨率为60,000（m/z 200时FWHM）的条件下，从添加浓度为10μg/Kg的韭葱样品中获得的乙酯杀螨醇（m/z 251.0025±5 ppm质量窗口）的提取离子色谱图。结果显示~38次扫描/峰（峰宽6s）。每次扫描所达到的极ng确度低于1 ppm（每第三次扫描标记一次）。峰上的平均RMS质量差异为0.6 PPM。

图5显示在所有三种基质中重复进样10次（浓度为10μg/Kg）的结果。所检测到的农药的%RSD小于10%，远低于SANTE指导文件所规定阈值（20%），表明在分辨率为60k条件下以全扫描模式所运行的Exactive GC系统达到了可靠分析农药所需的选择性和灵敏度，远低于各自的MRL。

图5.所研究的三种基质中，每种农药在浓度为10μg/Kg（n=10）条件下的峰面积重复性（%RSD）。图中还显示SANTE指导文件的阈值为20%。

表4.橙子中农药的方法性能结果总结。* LOD-200μg/Kg

可靠的质量极ng确度

当检测复杂样品基质中的低浓度农药时，获取可靠的极ng确质量数测定至关重要。在数据处理过程中，较低的质量误差可在使用窄质量提取窗时确保高选择性并有助于确保阳性检测的可靠性。通过辨别基质干扰和目标分析物离子的高质量分辨力，使用Exactive GC系统时可达到低质量误差。当分辨率不足时，两个离子质谱图重叠，造成目标化合物的读出质量数产生偏离。图6为在分辨率分别为15K、30K、60K条件下，对浓度为10μg/Kg的韭葱基质标准品所做的分析。

质谱图显示二甲嘧菌胺的定量离子和产生干扰的质量相近的基质离子。在 15 K 和 30 K 条件下，未能分离二甲嘧菌胺离子，致使质量极ng确度较差，分别为 10.1 ppm和 6.3 ppm。但在 60 K 条件下，离子被完全分类，达到预期质量极ng确度（小于1 ppm）。如达不到此质量分辨率，则此农药将达不到 SANTE 鉴定标准（＜ 5 ppm）且会出现假阴性结果（报告为“未检测到”）。这支持了先前的报告，即在某些情况下，为确保Z高选择性，分辨率需达到 60 K（200 m/z）。6

图6.在15K、30K和60K的分辨率条件下，分辨率对添加浓度为10μg/Kg的韭葱样品中二甲嘧菌胺诊断离子质量极ng确度的影响。在15K和30K条件下，二甲嘧菌胺离子未从干扰基质离子中分离出来，致使质量极ng确度分配较差。

表5.西红柿中农药的方法性能结果总结。

对51种农药的LOI处进行质量极ng确度评估，评估结果如图7所示。所有分析物的质量误差值均未超过1.2 ppm，远低于指导文件的限值（5 ppm），在极ng确的选择性检测中，提供Z高置信度。

在农药分析中，仪器应能够在整个可能遇到的分析物浓度范围内保持质量极ng确度，这点也非常重要。如因检测器饱和而造成高浓度农药超标，则无法接受。在Exactive GC系统中，通过使用自动增益控制（AGC）来控制离子的进入数量，从而保护Orbitrap分析仪免于饱和。这确保了无论浓度高低，均能保持良好的质量极ng确度。如图8所示，当韭葱基质中的浓度范围为0.5～500μg/Kg时，四种农药的质量极ng确度始终< 1 ppm。

 图7.三种基质中每种农药在LOI处的质量差异测定值

图8.韭葱中四种农药在0.5-500μg/mL的浓度范围内的质量极ng确度测定值。质量极ng确度保持在

1 ppm以下。

实际性能

在高通量常规农药分析实验室，质谱仪始终处于持续运行的状态，因此仪器在相对较长时间内保持同等性能水平非常重要。为评估Exactive GC系统在较长时间内的性能，在同一样品瓶中对浓度为10μg/Kg的西红柿提取物重复进样100次。开始分析前，安装一个新的进样口衬管，调谐离子源并校准MS。

在66小时的连续运行中未进行其他干预。结果表明，从进样器到MS，该系统性能持续稳定。图9显示经过100次进样，浓度为10μg/Kg的西红柿中的六氯苯、乙烯菌核利和氟乐灵的峰面积响应，其中RSD%分别为5.3%、4.6%和3.8%。此外，在未做进一步质量校准的情况下，分析持续时间内的质量极ng确度稳定性< 1.2 ppm（99% ≤1 ppm）（图10）。

图9.添加浓度为10μg/Kg的西红柿提取物的100次重复进样。结果表明，在66小时的连续运行中均保持良好的灵敏度。

图10.浓度为10μg/Kg的西红柿提取物中六氯苯、乙烯菌核利和氟乐灵100次进样的质量极ng确度(ppm)。在使用同一衬管且不进一步校正质谱仪或调谐离子源时获得的数据。

结论

本研究结果表明，与TraceFinder软件配用的Thermo ScientificExactive GC Orbitrap高分辨率质谱仪是一个高性能的分析系统，可在完全遵循SANTE指导文件的前提下，针对果蔬中的常规农药分析，提供稳定的、高灵敏度的分析定量性能。

—经检测，99.3%的农药/基质组合可在低于MRL下检测到，线性良好且符合所要求的性能标准。重要的是，在全扫描采集模式下，使用化合物数据库对目标数据进行处理增加了分析物的范围。

—当在复杂样品基质中筛选农药时，以60,000 FWHM的分辨率进行采集显著降低了基质干扰并提高了结果的置信度。针对较宽浓度范围内的所有化合物均达到sub-ppm的一致质量极ng确度，确保了化合物在不同浓度水平下检测的置信度。

—西红柿基质以10μg/Kg的浓度重复进样表明系统能在较长时间内保持性能一致性，符合常规检测实验室的要求。

【仪器/耗材清单】

仪器

ExactiveTMGCOrbitrapTM质谱仪

Thermo ScientificTMTriPlusTMRSHTM自动进样器

Thermo ScientificTMTRACETM1310气相色谱仪

耗材

包含5 m保护柱（P/N: 26096-1425）的Thermo ScientificTMTraceGOLDTMTG-5SilMS毛细管柱（30 m×0.25 mm I.D.×0.25μm）