基于CSR技术和内标法GC-MS 测定白酒中氨基甲酸乙酯含量

【概述】

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)，又叫乌拉坦（Urethane），是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病。人类从膳食中摄入的氨基甲酸乙酯，主要来自发酵食物和饮品，其中酒精饮品是已知的氨基甲酸乙酯主要来源。

调查显示，如果饮用氨基甲酸乙酯含量超过30×10-6g/kg的酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福尼亚环保机构的一项统计数据得知，假设每个人的患癌症的机率为1×10-5，推断氨基甲酸乙酯的摄入量大约为0.7μg/d。因此黄酒中氨基甲酸乙酯是危害人类健康的一个不可忽视的因素。国际上已就不同酒精饮品的氨基甲酸乙酯含量进行了广泛研究，一些国家已制定出酒精饮品的氨基甲酸乙酯Z高限量，如加拿大是就多种酒精饮品制订氨基甲酸乙酯Z高限量的国家，由30μg/L (葡萄酒)至400μg/L(水果白兰地)不等。美国、日本、韩国等亦相继制订出部分酒的氨基甲酸乙酯Z高限值。

【实验/设备条件】

1.色谱柱：TG-WAXMS  30 m×0.25 mm×0.25μm石英毛细管柱；

2.进样口温度：220℃；

3.升温程序：初始温度为50℃，保持1min，以8℃/min

升至180℃，保持10min；

4.载气：氦气（纯度≥99.999%）；

5.载气流速：1.0mL/min；

6.进样量：13μL；

7.进样方式：不分流进样。

8.离子源：EI源；

9.离子源温度：250℃；

10.传输线温度：280℃；

11.采集模式：SIM模式(44,62,74,89,64,76)。

【样品提取】

标准溶液的制备

1）极ng确称取0.0161g（极ng确至0.0001g）氨基甲酸乙酯标准品（纯度为98.5%），用甲醇溶剂、定容至10mL，此时

溶液浓度为1585.85μg/mL；

2）极ng确称取0.0334g（极ng确至0.0001g）D5-氨基甲酸乙酯标准品（纯度为98.7%），用甲醇溶剂、定容至10mL，此时溶液浓度为3296.58μg/mL；

3）100μg/mL氨基甲酸乙酯标准品溶液：取63μL（1）溶液，加937μL甲醇，定容至1mL，混匀。

4）100μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取30μL（2）溶液，加970μL甲醇，定容至1mL，混匀。

5）2μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取20μL（4）溶液，加980μL甲醇，定容至1mL，混匀。

6）10μg/mL氨基甲酸乙酯标准品溶液：取100μL（3）溶液，加900μL甲醇，定容至1mL，混匀。

7）0.5μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取50μL（6）溶液，加950μL甲醇，定容至1mL，混匀。

标准工作曲线溶液的制备

分别准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（0.5μg/mL）20、50、100、200、400μL和氨基甲酸乙酯标准中间（10.0μg/mL）40、100μL于进样小瓶中，各加2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100μL，用甲醇定容至1mL，得到10.0、25.0、50.0、100、200、400、1000ng/mL的标准曲线工作溶液，现配现用，供GC-MS分析。

样品制备

取100μL样品（95%乙醇），加入2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100μL，用甲醇定容至1mL摇匀待测。

【实验/操作方法】

本文按照GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了ISQ-LT GC-MS结合CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。

【实验结果/结论】

1采用CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯

1.1 CSR大体积进样原理介绍

溶剂浓缩大体积进样技术（Concurrent Solvent Recondensation,简称CSR），即在进样口和分析柱间连接一段空的预柱，且衬管中装填玻璃棉，采用传统的分流不分流进样口，进样口处于恒定的较高温度，自动进样器插入汽化室5 mm，保持针头部分温度较低，快速注入样品。样品以带状液体的状态离开注射器，被收集在衬管底部的少量玻璃棉上，开始缓慢汽化。由于衬管是一个密闭体系，蒸汽体积迅速膨胀，取代和压缩载气，使得衬管内压力迅速增大，而载气阻止了溶剂蒸汽从汽化室溢出，从而产生了“压力涌浪”效应，迫使溶剂蒸汽转移到低温的预柱上。溶剂蒸汽在柱头上冷凝形成液膜，进一步加速了蒸汽的转移，此时溶剂汽化和冷凝同时发生，使得进样体积不再受汽化体积的限制，从而实现大体积进样，预柱起承载样品的作用。图1为CSR基本原理图解，图2为CSR进样过程。

图1. CSR基本原理图解

图2. CSR进样过程

1.2 CSR大体积进样技术特点

PTV进样虽然进样体积可高达250μL，但是在溶剂蒸发的过程中会造成低沸点化合物的损失；而OCI进样虽然不会造成低沸点化合物损失，但由于样品溶液直接注入到色谱柱中，很容易造成色谱柱的污染，导致某些化合物响应偏低、且影响分离。相比，CSR技术更具有优越性，具备以下三个特点。

（1）特点一：显著提高检测灵敏度

CSRZda进样体积为50μL，能显著提高检测灵敏度。例如：CSR大体积进样气相色谱质谱中的应用，如图3所示，进样量为1、2、3、4、5μL时所得的结果比较，从图中可以得出，随着进样体积的增加，响应值几乎呈线性倍数增加，充分表明增加进样量可以显著提高检测灵敏度。

图3.不同进样体积结果

（2）特点二：分析高、低沸点化合物无歧视

如图4所示，以正己烷为溶剂，不同环数烷烃的大体积进样分析，进样体积35μL。从图中可以看出比正己烷溶剂多两个碳的化合物C8，并未随溶剂蒸发损失，且高沸点的C40具有较好的响应及分析精密度，进一步证明了CSR对低沸点和高沸点化合物均无歧视效应。

图4.低、高沸点化合物无歧视

（3）特点三：简化前处理过程，避免低沸点化合物浓缩时有损失

如图5所示，在环境水体中PAHs的分析，一般需要浓缩1000倍，进样量为1μL，采用液液萃取和SPE小柱富集两种方式均消耗大量溶剂，且费时，在氮吹浓缩过程中容易造成低沸点PAHs的损失。因此可以采用类似液液微萃取的方式，只需1mL有机溶剂，20mL水样，无需氮吹浓缩，萃取后可直接进样分析，进样量为50μL，可达到相同效果，甚至更好，既可以大大减少样品前处理过程，并避免低沸点化合物的损失。同样，在农残分析过程中，如敌 百虫、敌敌畏、甲胺磷等低沸点农药在旋转蒸发和氮吹浓缩过程中也容易损失一部分，从而造成结果不准确，因此可以采用CSR技术来解决这一问题。

图5.简化前处理过程

2典型色谱图

图6. std200μg/L

图7. 95%乙醇样品

其中样品中氨基甲酸乙酯平行测试结果为：27.15和23.41 ng/mL，平均值为25.125 ng/mL。

3检出限及线性相关系数R2

连续5天每天的校准曲线，相关系数R2范围0.9997～0.9999。

表1.检出限及线性相关系数R2

4响应值重复性

（1）日内重复性：将25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液（含同位素内标）一天内连续进样6次，计算TIC峰面积RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（2）日间重复性：将上述标准溶液6天内每天进样3次（每次间隔应≥2小时），计算TIC峰面积RSD%，分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（3）结果表明：目标峰和内标峰响应值日间重复性分别为2.74%、4.20%；日内重复性分别为2.55 %、2.89%，重复性良好。

表2.响应值重复性

5保留时间重复性

（1）日内重复性：将25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液

（含同位素内标）一天内连续进样6次，计算目标峰保留时间RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（2）日间重复性：将上述标准溶液6天内每天进样3次（每次间隔应≥2小时），计算目标峰保留时间RSD%，分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。

（3）结果表明：目标峰和内标峰保留时间日间重复性为0.00、日内重复性为0.06%，重复性良好。

表3.保留时间重复性

6系统抗污染能力

使用标准中规定的校准曲线Zda浓度标样（1 mg/mL），连续进样分析20次，报告响应值重复性RSD%，**次和Z

后一次响应值之差的值与平均响应值的比值。表4所示，系统抗污染能力目标峰为0.02、RSD为3.44%；内标峰为

0.03、RSD为3.05%，系统抗污染能力强。

表4.系统抗污染能力

结论

按照GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了ISQ-LT GC-MS结合CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，进样量为13μL，考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。实验结果表明：在10.0～1000ng/mL浓度范围内，相关系数R2范围0.9997～0.9999，线性良好；检出限为0.033 ng/mL；响应值日间日内重复性2.55～4.20%

之间；保留时间日间日内重复性0.00～0.06%之间；系统抗污染能力目标峰为0.02，内标峰为0.03，结果良好，同时

CSR大体积进样技术可以提高检出限和灵敏度，该方法满足分析检测的要求。

【仪器/耗材清单】

仪器

Thermo ScientificTM ISQ单四极杆气质联用仪，包括：

-TRACE 1310气相色谱，配分流不分流进样口

-ISQ LT单四极杆质谱

- AS1310自动进样器

Thermo ScientificTM TraceFinder 3.2.512.0数据处理系统统

耗材

Thermo ScientificTM毛细管色谱柱TG-WAXMS（30 m×0.25mm×0.25μm、P/N 26088-1420）。

Thermo ScientificTM KIT SSL-LV TRC1300（P/N 19050725）

Thermo ScientificTM 预柱（5 m×0.32 mm）（P/N 26080010）

Thermo ScientificTM 玻璃两通（universal press fit connectors，P/N 35003850）

Thermo ScientificTM超惰性不分流衬管（P/N 453A1925-UI）

Thermo ScientificTM低流失进样口隔垫（P/N 31303233）

Thermo ScientificTM 10μL液体进样针（P/N 36520060）

Thermo ScientificTM 50μL液体进样针（P/N 36503015）

Thermo ScientificTM 气相色谱进样口石墨垫0.32mm（P/N290VA192）

Thermo ScientificTM 质谱端石墨垫0.25mm（P/N 29033496）

Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶（P/N C4000-88W）

Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶样品架（5×10，C4012-25）

Thermo ScientificTM 10～100μL移液器（JH91538）

Thermo ScientificTM 100～1000μL移液器（JH91348）

试剂与标准品

1）甲醇：色谱纯；

2）样品：95%乙醇（分析纯）。

3）标准物质：氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯购置于德国Dr.E公司。

【参考文献】

[1]食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定.GB 5009.223-2014.