常用的融合标签

一．蛋白标签是什么？

蛋白质标记（Protein Tag）技术，是指通过运用基因克隆手段使具备特异功能的多肽、蛋白质结构域，或者将完整蛋白质和靶蛋白质融合到一起，以进行对靶蛋白质表达水平的纯化、测定与示踪之技术。

二．亲和标签对融合蛋白的影响？

1. 增加融合蛋白质的表达量：在亲和标记与靶蛋白的结合表达研究中，如果某些亲和标记在靶蛋白的N末端，如小泛素相关修饰基因（Small ubiquitin-related modifier，SUMO）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）等，通常都能够明显提高重组蛋白质的产量。亲和标签提供了一个可靠的翻译起始位点，使核糖体能够高效地翻译甲硫氨酸（N端），从而促进融合蛋白的表达和产生。

2. 增强融合蛋白的可溶性：当前为了克服大肠杆菌表达重组蛋白易产生包涵体缺点，研究相对较多的方法就是亲和标签与目的蛋白融合表达。其中，MBP标签的助溶性被研究的较深入。通过改变MBP构象的“开”和“闭”平衡，可以显著影响MBP的助溶能力。说明MBP的助溶性与蛋白本身的“开放”构象相关。

3. 促进了蛋白质的正常折叠:蛋白质是否正常折叠主要依靠其本身的氨基酸顺序，亲和标签则起着帮助正常折叠的功能。不同目标蛋白的最适标签还需要通过众多的实验来验证。亲和标签也能够控制结合蛋白的降解，从而增加对融合蛋白结合分析的敏感性。

三．常用的亲和标签

1.短肽标签

1.1 组氨酸标签His-Tag：由5-15氨基酸残基组成，约0.84KDa。其纯化配体为固化金属离子：镍、铜、锌、钴。标签特性为：（1）标签分子数量少；（2）可在无离子型表面活性剂产生的环境下或变性环境下纯化；（3）蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；（4）免疫原性相对较低，可对纯化的基因直接注射动物进行免疫制备抗体；（5）可使用于多表达体系，纯化环境温和；（6）构建双亲和标签。

1.2型FLAG标记：由八个氨基酸残基所组成的（DYKDDDDK），纯化配体为抗FLAG单抗，该标记具有天然的亲水基特性，因为分子规模较小，所以它既无法掩盖靶基因的抗原表位和结构域，又不会干扰结合基因的功能，而且可以被肠激酶所切除。该标记的三种特异性单抗，分别为：M1单抗、M2单抗、M5单抗。M一单抗能够识别N端FLAG标记（Ca2+存在下）；而M五单能够结合Met-FLAG标记的融合蛋白，但却无法识别C端的FLAG标记。而M二单抗则能够在Ca二+缺失的情况下，识别并结合为N端Met-FALG标记、FLAG以及C端FLAG标记

1.3 Strep-tagⅡ标签：标签可以融合到蛋白质的任何位置，标签的纯化条件比较广泛，融合蛋白可以用2.5 mmol/L的脱硫生物素洗脱，而且不依赖于金属离子，所以含有金属离子的蛋白质适合做标签。

1.4 CBP标签：由26个氨基酸残基组成，约4KDa，纯化所用配体为固相钙调蛋白。标签特性为：（1）结合于N端或C端均可；（2）可以被凝血酶及肠激酶消除；（3）在低强度钙缓冲液中，可以差异性的被钙调蛋白树脂所捕捉及吸收，同时在中性环境中可以被2 mM EGTA洗脱，反应对环境比较温和。

1.5c-Myc标记法：由十一个氨基酸残基组成，已成功使用于WB杂交技术、免疫沉淀术以及流式细胞学计量技术等，可用来监测重组后蛋白质在靶细胞内的表现。

2.蛋白标签

2.1 GST标签（谷胱甘肽巯基转移酶）：它由211个氨基酸残基组成，大小约26KDa，纯化的配体为谷胱甘肽树脂。GST标签不仅能在一定程度上提高融合蛋白的溶解度，还能提高蛋白产量，有利于后续的纯化。同时，GST标签的纯化条件温和、高效翻译、亲和介质成本较低，现阶段已成为常用的标签之一。

二点二MBP标记：主要由三百九十六个氨基酸组构成，大小仅为40KDa，对于重组基因在原核生物系统内的可溶性表达有着重要性。试验结果显示，保持在MBP的“开”和“闭”构象之间的平衡会极大地改变MBP标签的溶解度，这意味着当MBP标签处于“开”的构象状态之后，它就可以特异性地与亲和树脂材料的工艺结合。MBP标签可以融合到蛋白的N/C端，可以被肠激酶特异性识别和去除。

1.5 Halo标签：由300个氨基酸残基组成，33KDa，纯化配体为氯化烷烃。标记特性：（1）能够融合在基因的N端或C末端；（2）能够发现和亲和结合的固相化固定目的基因；（3）目标配基必须是可以在体外或体内与Halo-Tag共价融合的小分子化合物。

3.其它标签

四．亲和标签的组合使用

1.His6-MBP：结合的蛋白为His6-MBP靶蛋白，其His标记主要用作对结合蛋白的亲和纯化，而MBP标记则主要用作提高蛋白的可溶性表达。在组合标记的靶基因中间添加了烟草蚀刻病毒蛋白酶的特异性识别切割位点，更有利于标记的去除。

2.串联亲和纯化：在不破坏靶蛋白调控序列的情况下，将TAP标签（蛋白标签）嵌入靶蛋白的一端，通过两步亲和层析获得接近自然状态的特异性蛋白复合物，用质谱法对蛋白质进行鉴定。

五．融合标签的应用

1.蛋白纯化：标签的最普遍用途。例如，His-Tag广泛应用于大肠杆菌蛋白和细胞内源蛋白的纯化。

2.Western Blot检测：可以通过有匹配的抗体的小分子标记物来监测蛋白质的表达。FLAG-Tag分子量较低且具有许多与之配套的商业化抗体，因此成为了WB实验中使用的重要标记。

3.免疫沉淀反应：常用的标签有FLAG-Tag、HA和cMyc。

4.活细胞图像：荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是在活体细胞图像中的常用标记蛋白。

卡梅德生物多年致力于重组蛋白表达与制备研究，设计了一套包含多种融合标签（His、GST、FLAG、SUMO等标签）的表达载体，以保证高可溶蛋白表达和高蛋白活性，以保证每一个重组蛋白制备的品质，为客户提供优质的服务。