Fab抗体噬菌体展示流程

1. 什么是fab抗体

Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，也叫做抗原结合片段，涉及到抗体-抗原结合的亲和力，抗体特异性等特征。抗体Fab片段含有1个可变区(V区)和1个恒定区（C1），V区含有3个互补决定结构域（CDR），涉及到独特型抗体的产生，抗体的超频突变，尤其是CDR3结构域是抗体工程改造的核心区域；C1区主要起结构支撑作用。

图1：fab抗体示意图

2. fab抗体文库优点

重组Fab的优势比较明显，由于不具备Fc区，从而不需要翻译后修饰和糖基化，可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。生产Fab片段，通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点，但容易形成包涵体，复性后活性难保证。

3. scfv抗体和fab抗体区别

表1：fab抗体与scfv抗体区别

4. fab抗体文库应用

Fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点，使Fab成为了医药研究领域的重要成员之一，Fab类药物在预防、诊断等领域有着广泛的应用，例如：已经上市的赛妥珠单抗酯（一种Fab片段，Cat：YR1612），可以有效地针对类风湿性关节炎；作为Fab片段的美妥昔单抗I也已经用于治愈肺癌等。

5. 卡梅德生物能够为客户提供高质量的fab抗体噬菌体展示服务

卡梅德生物（KMD Bioscience）多年来致力于抗体领域研究。我们积累了丰富的抗体文库构建经验，能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的fab抗体文库构建服务。

6. 卡梅德生物为客户提供fab抗体文库构建服务的全流程介绍

卡梅德生物为客户提供fab噬菌体文库构建服务，流程包括：抗体cDNA制备，基因扩增，载体构建，电击转化，抗体鉴定，fab文库包装。

图2：fab噬菌体展示抗体库构建流程

6.1 抗体cDNA制备

6.1.1 外周血单核细胞单克隆化

客户提供Human peripheral blood lymphocytes，Lymph node cells或spleen cells（保存在RNA later等溶液中，避免RNA降解，蓝冰运输），EBV病毒单克隆化。

6.1.2 总RNA提取

将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，加入氯仿，离心后取上清加入异丙醇，离心保留沉淀，加入75%乙醇后离心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育确保RNA溶解，将各管混合到一管中即为总RNA，取总RNA进行电泳，取 总RNA 用核酸浓度测量仪测浓度。

6.1.3 反转录获取cDNA

按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备，将上一步得到的RNA反转录成cDNA。

6.2 基因扩增

以cDNA为模板扩增抗体重链（Fd段）和轻链可变区基因。

图3：Fd和轻链PCR扩增结果

6.3载体构建

PCR 扩增的 Fd 片段产物（通过琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，通常约350ng与2μg Xho/Spe I 线性化的 pComb3 载体（通过分离琼脂糖凝胶电泳）在150μL 的总体积中与连接酶在 16℃下反应 15小时，命名为P+Fd。PCR扩增的轻链片段产物和重组的p+Fd（琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，连接、转化，将具有Fd和κ轻链的噬菌粒命名为pComb3H +κ+ Fd。

6.4电击转化

6.4.1将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库

取大肠杆菌感受态细胞，加入回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入培养基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用培养基和涂布棒冲洗刮下，加入甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。

6.4.2 fab噬菌体文库筛选

6 孔板（Nunclon™）用等量的外周血淋巴细胞包被 5×106 个细胞，然后在4℃下用 BSA/PBS 封闭过夜。每孔加入 1 ml 噬菌体文库，37℃孵育 2 h。对于第 1、2、3、4 和 5 轮，分别用 TBS/ 吐温 20 (TBST) 洗涤未结合的噬菌体 1、5、10、10、10 次。通过添加洗脱缓冲液（0.1 M HCL，用固体甘氨酸调节至 pH 2.2 并含有 0.1% BSA）洗脱结合的噬菌体，并用 2 M Tris 缓冲液，pH 8.0 中和洗脱溶液。如上所述遵循 VCSM13 辅助噬菌体的扩增程序，同时在 LB-氨苄青霉素平板上滴定输入和输出噬菌体。噬菌体结合、洗脱和扩增步骤进行5轮。

6.5抗体鉴定

随机挑选20-50个克隆，PCR鉴定阳性率，测序和分析抗体序列。

图4：阳性率:>90%

6.6 fab文库包装

交付＞1x1013噬菌体颗粒/ml。

传统的杂交瘤技术生产单克隆抗体成本高，而且产生的鼠源抗体往往具有触发人抗小鼠抗体（HAMA）反应的缺点。因此，通过噬菌体展示技术产生的重组 Fab 抗体可以成为治疗肿瘤的合适替代方案。卡梅德生物为您提供的人源Fab抗体文库构建服务亲和力高，库容量高，独立克隆数107-1012，根据客户需求制备，为每一个客户量身定制实验方案。