经典磁珠一文解读 | 改进先导编辑的内源小RNA结合蛋白La

2024-07-18119

Prime Editing，先导编辑是2019年由刘如谦（David Liu）团队提出的新型基因编辑技术。^[1]它无需依赖DNA模板和DNA双链断裂，能够实现单碱基对的替换、小片段的插入或删除。

Figure1. 先导编辑器及pegRNA^[1]

先导编辑系统包括含DNA切口酶（Cas9 nickase，nCas9）和工程逆转录酶（RT）的融合蛋白元件，以及先导编辑向导RNA（PE guided RNA，pegRNA）。pegRNA由指定目标位点的间隔体（spacer），sgRNA支架和一个编码所需编辑的3'端扩展组成。通过pegRNA 引导 Cas9 nickase 切割 DNA 单链，逆转录酶依照未配对 pegRNA 序列合成新的 DNA 序列，并最终整合到DNA 中，完成基因编辑。

Figure2. Prime Editing先导编辑流程示意^[1]

已有研究显示先导编辑效率的因素包括编辑组件的表达、稳定性、定位和活性，以及目标位点的染色质背景等等。^[2-3]近日，普林斯顿大学 Britt Adamson 团队在Nature发表Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein，^[4]报道了一项对先导编辑技术的改进。为了找出影响先导编辑效率的细胞决定因素，研究者开发了可扩展的Prime Editing报告系统，进行CRISPRi筛选。筛选发现La蛋白是Prime Editing最强的介导因子。而在更进一步的实验中，La蛋白在不同的先导编辑器（PE2、PE3、PE4和PE5）、不同编辑类型（碱基替换、插入和删除）、不同内源性位点和细胞类型中都显示出对先导编辑过程的促进。

Figure3. 基因组规模的 CRISPRi 筛选将 La 确定关键因素，b. Prime Editing报告系统设计c. 使用 SaPE2 编辑器、+7 GG-to-CA 编辑和 PE3 方法进行基因组规模 CRISPRi 筛选，流式细胞分选报告细胞基因水平表型结果。^[4]

在细胞内，La蛋白已知可以结合新生RNA聚合酶III转录产物3'端的polyU。研究者发现La蛋白与pegRNA的3'端多聚尿苷化有相互作用，而La蛋白的末端结合活性保护和促进了先导编辑。

Figure4. 将 La RNA 结合的 N 端结构域与 PEmax 融合改善先导编辑。^【4】

基于这一发现，他们开发了一种新型先导编辑蛋白PE7，该蛋白融合了La蛋白的RNA结合域和标准的先导编辑蛋白，显著提高了在多种细胞类型和基因组位点的效率。随后，研究团队对PE7编辑器在多个特定疾病基因位点，以及人类原代细胞的编辑能力进行评估，为遗传性疾病治疗提供了新的可能性。这项研究不仅增进了我们对先导编辑机制的理解，也为未来基因编辑技术的优化和应用提供了潜在的方向。

Figure5. PE7 增强疾病相关靶标的先导编辑效率。^[4]

SPRISelect磁珠的先导编辑器实验应用

SPRIselect试剂盒针对不同核酸应用场景筛选不同大小范围的核酸片段。具备高重复性和室温稳定性。无需柱纯化，无需跑胶切胶，高回收的核酸片段纯化筛选，让你的实验操作如此简单可靠。在Britt Adamson 团队的文章中，数次采用SPRISelect完成多种先导基因编辑器相关实验：

● 体外转录（IVT）先导编辑器mRNA：研究人员使用体外转录技术生成先导编辑器mRNA，其中采用SPRIselect磁珠完成修正T7启动子的IVT模板PCR产物纯化。

● 基于流式细胞分选的CRISPRi筛选：根据GFP表达水平进行细胞分选后，采用SPRIselect磁珠纯化PCR扩增hCRISPRi-v2 integrated sgRNAs的产物。

● 小RNA测序：研究人员使用小RNA测序来研究La蛋白对pegRNA稳定性和完整性的影响。其中采用SPRIselect磁珠完成文库片段大小双侧筛选。

● T cell 分离、培养、先导编辑：在评估T细胞先导编辑效率实验中，采用SPRIselect磁珠进行转染后gDNA特定位点PCR的产物纯化，以及建库文库PCR纯化。

基于SPRI固相可逆固定化技术的AMPure XP及SPRIselect两种NGS文库纯化(clean up)和片筛(Size selection)已被超过20000+论文和200+测序建库试剂盒使用。

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● 文章来源：

1. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature volume 576, pages149–157 (2019)

2. Chromatin context-dependent regulation and epigenetic manipulation of prime editing. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.04.12.536587 (2023).

3. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nat. Rev. Genet. 24, 161–177 (2023)

4. Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein，Nature volume 628, pages639–647 (2024)