建议收藏 | 分析超速离心法检测腺相关病毒空壳率SOP

2024-07-18 17:15:11 99阅读次数

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腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)因其安全性高、免疫原性低、长期稳定表达等优点而成为基因治疗中最重要的载体之一。然而，AAV生产过程中产生的空病毒颗粒、部分病毒颗粒以及完整病毒颗粒，尽管在大小上难以区分，却对其潜在治疗效果有着显著影响。在众多检测方法中，分析超速离心法（Analytical Ultracentrifugation, AUC）以其卓越的区分能力和精确的量化能力，被公认为评估AAV空壳率的金标准。为了提升大家对分析超速离心法的实操水平，并确保AAV空壳率检测的准确性与一致性，本SOP旨在为使用AUC进行AAV空壳率检测提供详尽的指导。

一、样品测试要求

样品准备：

1. 要求纯度较高，最好为超离或层析后的样品。

2. 要求样品性质稳定、均一。

Buffer要求：

a. Absorbance Optical System

1. Buffer：避免含有在检测波长处有吸收的物质。Buffer中尽量避免DTT与β-Me（它们产生的吸收信号可能会随时间变化而变化）

2. 样品浓度较高时（超过紫外检测上限）需要用干涉光检测器。

b. Interference Optical System

1. Buffer：要求Reference与样品所在缓冲液完全一致，必要时通过分子筛或透析的方式使Buffer保持一致。

注：AAV样品若用碘克沙醇纯化，若有碘克沙醇残留，影响紫外检测器检测，可通过超滤对样品进行预处理后，再进行检测。或者使用干涉检测器进行检测。

AUC-SV样品推荐浓度：

通常推荐的浓度为0.1 OD-1.5 OD。

样品用量：

350-380μL

BS-AUC检测样品用量：

整体样品用量为AUC-SV的1/50，仅需10μL样品。

DGE-AUC检测样品用量：

整体样品用量为AUC-SV的1/30，可实现对生产中的过程样品检测。

检测通量：

通常一次7个样品，利用RI光强数据，将其通过软件转换成以RA的吸收数据，一轮实验可检测14个样品。一天可检测3轮。

单次检测时间：

AUC-SV(约4h)，BS-AUC(约4h)和DGE-AUC(3h)。

二、提前需要准备的物品

以下展示了SV-AUC的操作流程：

标记的红色物品需要提前准备

三、样品池组件展示

四、组装步骤

擦拭视窗（蓝宝石材质）：

用柔软的无尘布/纸擦拭视窗，擦拭干净对于后续检测非常重要，要做到的是无污物、无尘，可以从侧面（看反光）和正面（看尘埃）。擦拭的时候注意不要造成划痕或者摔碎玻璃视窗。

玻璃视窗有两种材质：

1）石英quartz：波长范围180-800nm

2）蓝宝石sapphire：硬度更高，寿命较长，检测波长范围230-800nm

注意：本次实验使用蓝宝石材质视窗。

组装蓝宝石视窗（2组）：

一套蓝宝石视窗含有如下三个部件：

视窗基座（window holder）、视窗垫片（window gasket）、视窗衬垫（window liner）

1）先将透明的视窗垫片放进黑色的视窗基座中铺平。垫片是可以重复使用的，只要没有明显形变、折痕、损坏。

2）然后将视窗衬垫放入视窗基座中，此时注意垫片的光滑面朝向基座壁，粗糙面朝向蓝宝石。同时要注意方向，用衬垫把基座上的缺口（红色箭头处）挡住。部件组装好以后，无需频繁拆卸。如下图：

3）装入蓝宝石视窗到基座中。注意有蓝宝石刻线（红色箭头处）的一侧朝上，并且蓝宝石刻线要与视窗基座上的刻线（蓝色箭头处）对齐。

将 “视窗组件-中心件-视窗组件“的“三明治”依次放入样品池外壳中，三明治如下：

注意：

1）视窗组件的玻璃面要贴近中心件，如上图所示。

2）视窗基座和中心件上的凹槽（蓝色箭头处）要对齐样品池外壳上的定位条（红色箭头处），垂直放入。

中心件有两种材质：

树脂：常用，最高转速42000RPM。

铝制：最高转速60000RPM，需红色垫片耗材。

如果在放入中心件的过程中感觉阻力较大，首先先确认是否对齐，如已对齐可以稍用力推下（不要用很大力气），如果阻力非常大，建议放4℃遇冷，让其冷缩后再放入；样品池组件应按照成套管理，不建议各个配件混用！

注意本次AAV实验所用中心件为树脂中心件，下图操作演示为铝制中心件。

放入螺纹环垫圈，然后拧上螺纹环。螺纹环的 “OUT “字样（红色箭头）朝上，并借助工具（蓝色箭头）拧紧。

5、借助扭力扳手充分拧紧样品池，扭力要达到120N.m。

四、上样及实验参数设定

1. 样品上样量380μL，buffer加样量400μL，注意不要加反（如果使用光强数据，2扇形同时加满样品）。

2. 样品池配平，重量差异在0.5g以内。

3. 将样品池放入转子中，注意转子刻度线和样品池刻度线对齐；若碰到无法严格对齐的情况（转子公差引起），对齐方式需偏向一侧，如下图所示。（样品测试前，建议使用BSA进行测试，确认不同Cell数据一致性）

4. 温度：20℃，温度浮动0.1℃以内，需平衡2h左右。

5. 使用AN 50Ti（8孔）转子；转速：16000rpm（根据样品情况调整）；波长（Wavelength）：230 nm；采集数据条数(Scan Count)：85条（根据实际情况可调整）；频率(Frequency)：145 s（根据实际情况可调整）；推荐径向分辨率：10um（默认值）。

五、AUC实验门户操作及仪器控制面板操作

1. 样品池与counterbalance配平后放置于转子中，使用紫外可见吸收检测方法，温度为20℃。

2. Stage 1：0 rpm, 1 h（抽真空、平衡温度，可设置2h，温度平衡后跳过）。

3. Stage 2：16000rpm，Scan Count 85，Wavelength 230nm，Frequency 145 s。

六、数据分析

选中某一个特定样品池的x条以“RA”为后缀的数据，全部导入Sedfit软件；在Model中选择Continuous C(s) Distribution模型，点击Parameter，输入相关参数。

（也可参照后续Optima AUC cGMP Suite升级软件进行数据处理）

1. resolution: 200 。(最后拟合生成的图像是由多少个点组成(100-200))

2. s min:0.1 (X轴的最小值)

3. s max:200 (X轴的最大值)

4. frictional ratio: 1 （AAV为二十面体微小病毒，近球形）

5. Baseline: 0，并且勾选。（基线正常都是0）

6. Fit RI Noise：勾选。

7. Fit Time Independent Noise: 勾选。

8. Meniscus: 需要移动红线至样品弯液面的峰尖位置，样品加样量380μL，其弯液面一般在6.08附近，一定要勾选并进行拟合。

9. Bottom: 7.2。

10. Confidence level:0.68

11. Partial spec. volume:0.73

12. Buffer density:1.00000

13. Buffer Viscosity:0.01002

14. 第一根绿线位置(靠近弯液面)：Meniscus+0.01~0.015 cm

15. 第二根绿线位置(靠近底部)：7.1 cm

16. 为了使Fit的速度更快，可将resolution设置为50进行“Fit”,待拟合完成后，可将resolution设置为200，进行“Run”。

我们期望通过此SOP每位研究人员和技术人员都能够深入理解并熟练掌握分析超速离心法（AUC）的具体操作流程和应用技巧。本SOP旨在作为一份的实践参考手册，帮助用户从理论到实践，逐步深入AUC技术的核心。关于AUC的方法学验证内容，请参考《Methodological Validation of Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation Method for Adeno-Associated Virus and Collaborative Calibration of System Suitability Substance》。