Sephadex LH-20助力传统中药的分离纯化

2024-09-05123

“出海” 的是中国文化！最近大热的《黑神话：悟空》通过游戏圈带来了强大的民族自豪感，而在生物圈中，传统中药也许可以成为下一个悟空。

中医药是中华民族的瑰宝，中医药学是中国古代科学的瑰宝。TCM是传统中药的简称 (Traditional Chinese Medicine) ，传统中药的化学成分极其复杂，有效成分种类很多，诸如生物碱、甙、黄酮、醌、多酚、内脂、香豆素、萜、有机酸、寡糖、多糖、环肽、甚至蛋白^[1]。

Sephadex LH-20填料专门用于天然产物（如类固醇、萜类化合物、脂质和低分子量肽）的制备级纯化，同样也是TCM分离纯化的一柄利器。

图1：Sephadex LH-20化学结构图（部分）^[2]

Sephadex LH-20填料

的主要特点与性质

填料同时具有凝胶过滤层析和吸附型层析的复合层析模式。

填料由交联Sephadex G-25葡聚糖凝胶经过羟丙基化制成。

干粉填料的平均颗粒粒径是70 μm，在甲醇中溶胀后的填料平均颗粒粒径是103 μm。

填料的工作pH耐受范围以及清洗pH耐受范围都是2-13，这意味着填料可以耐受绝大多数水相缓冲液和有机溶剂，除了pH低于2的强酸溶液以及浓度超过0.1 M NaOH的强碱溶液。

Sephadex LH-20填料可以耐受湿热灭菌，即121摄氏度20分钟的高温高压灭菌。

排阻信息：4000–5000 Da（取决于所使用的溶剂种类），大于排阻极限的生物分子走外水出峰，其他小分子进入凝胶层。

使用时推荐的线性流速：60 cm/h。

图2：Sephadex LH-20填料的主要性质

溶胀

Sephadex LH-20产品目前仅以散装填料形式售卖，没有预装柱产品。散装填料以干粉形式包装，在使用前需要完成的第一步就是填料的溶胀。

在室温下，用过量的实验所用溶剂将干粉填料溶胀至少3个小时，一般采用过量溶剂过夜溶胀。需要注意的是，在整个溶胀过程中避免过度剧烈的搅拌，比如切勿使用磁力搅拌器，可以选用轻柔温和的搅拌方式。

一定要用实验时所用的流动相去溶胀填料和装柱，由于不同试剂之间的溶胀系数差异较大（图3），溶胀时和实验时采用的流动相不同会导致填料柱床的高度发生显著的变化。针对不同样品，根据已有的文献报道或者使用经验来选择合适的流动相。

图3：在不同溶剂中，Sephadex LH-20干粉溶胀后的填料体积

举例说明：如果后续实验过程中所使用的流动相是100%纯甲醇，那么就使用100%纯甲醇对干粉填料进行溶胀，甲醇的溶胀系数是3.9-4.1 mL/g干粉，取中位数4.0进行计算，如果取25 g Sephadex LH-20干粉，溶胀时间是室温条件下至少3个小时，溶胀后的填料体积大约是100 mL。

为了保证较高的分辨率，建议样品的上样量是整个柱子柱体积的1%-2%，柱体积100 mL也就意味着单次上样体积约1-2 mL。样品和所有缓冲液都需要经过离心或者0.45 μm的膜过滤以去除不溶物。

装柱

推荐的胶悬液比例：75%的填料与25%的溶剂

推荐的装柱流速：300 cm/h的线性流速

推荐的装柱压力：空柱的压力耐受是直接限制因素而非填料的压力耐受，可以在空柱所耐受的最大压力下进行装柱

空柱

产品说明书中推荐搭配Sephadex LH-20使用的是耐受有机溶剂的SR (Solvent Resistant) 空柱，但SR空柱产品目前已经全部停产。

作为替代产品，优先推荐使用Tricorn空柱，Tricorn 5 mm直径的柱子柱管最高20 cm，可以装填4 mL填料；Tricorn 10 mm 直径的柱子柱管最高60 cm，可以装填47 mL填料。需要注意的是，最好更换Tricorn空柱的密封圈以获得更强的化学耐受性，例如Solvent-resistant O-rings (PFR, perfluoro-rubber)（货号18115303用于Tricorn 5 mm空柱，货号18115312用于Tricorn 10 mm空柱），可以耐受100%纯甲醇。

建议在选择合适大小的空柱前，根据实验所需要使用的具体化学试剂，确认空柱及其零部件是否耐受。

清洁和保存

填料使用完毕后，建议用2-3倍柱体积的洗脱液进行冲洗再生，如果后续实验的流动相发生变化，需要用新的流动相重新进行平衡。

Sephadex LH-20干粉填料可以在4-30摄氏度的条件下保存，装填好的柱子和已溶胀后的填料建议在4-8摄氏度冰箱保存，选用抑菌剂或20%乙醇作为保存液即可。

案例分享

Sephadex LH-20填料可用于研究用途的脂质分离和纯化复杂有机物如中药，成功的研究案例包括^[2]：

多肽及非多肽抗生素；

脂质及去垢剂；

毒素及污染物；

类固醇、鞣酸以及植物提取物，如台湾相思树茎皮抗氧化剂活性^[3]、玉米花粉和蜜蜂蜂巢花粉的自由基清除活性^[4]、赤松松针的抗氧化剂活性^[5]等。

原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins，简称OPC）是一种常见的植物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。从冻干的榴莲籽中得到OPC粗提物后上样到Sephadex LH-20柱子上，通过50%甲醇水溶液洗杂去除糖类杂质，用70%丙酮水溶液洗脱得到较纯的原花青素，再利用旋转蒸发器去除丙酮后通过NMR方法解析结构^[6]。