使用 PyroGene 重组因子 C 试剂盒进行内毒素检测

简介
在制药和医疗器械生产过程中，对污染物样品的监测是一个关键步骤。内毒素存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁中，是一种常见的污染物，可引起发烧、炎症、头痛、恶心，甚至死亡。内毒素的常规检测方法是鲎试剂溶酶法 (LAL)，核心成分是鲎的血液中提取而来。在内毒素存在的情况下，LAL通过酶促级联凝固，可以通过比浊法或显色法定量 ( 图 1A )。这些方法涉及多个酶的步骤，并取决于鲎的可用性。龙沙公司生产的 PyroGene 重组因子 C 试剂盒 (rFC) 提供一种定量检测的方法，通过一步酶促反应，不借助于动物衍生产品，与 LAL 方法具有相同的灵敏度。在内毒素存在的情况下，活化的 rFC 会裂解荧光基质，导致荧光信号的增加 ( 图 1B )，这与内毒素的含量成正比。

材料
• PyroGene 重组因子 C 终点法荧光检测试剂盒 (Lonza cat. #50-658U)
• LAL Reagent Grade™ Multi-well Plates (Lonza cat. #25-340)
• Pyrogen-free Dilution Tubes Lonza cat. #N207)
• LAL Reagent Water (Lonza cat. #W50-640)
• SpectraMax i3 或 i3x 多功能微孔板读板机 ( Molecular Devices 公司其它支持荧光检测的微孔板读板机均可以使用 )
• SoftMax Pro 软件 (Molecular Devices)

优势
• 一步酶促反应以及非动物衍生产品特点完成检测，可确保样本的安全性
• 利用 SpectraMax 系列微孔板读板机可获得更高的灵敏度
• SoftMax Pro 软件的 Workflow方式进行读取-孵育-读取的自动化流程节省了大量时间

方法
用试剂盒提供的冻干的 E. coli O55:B5 内毒素按照瓶上 LAL 试剂水的体积进行配置，得到 20 EU/mL 的原液。将配置好的原液高速震荡混匀 15 分钟，用旋涡搅拌器使其完全溶解。用 LAL 试剂水稀释原液，每次稀释时用力摇匀，制得浓度标准:5 EU/mL、0.5 EU/mL、0.05 EU/mL、0.005 EU/mL、0.001 EU/mL。经过优化后 PyroGene 试剂盒检测的线性范围为0.005 EU/mL 至 5.0 EU/mL，增加了额外的标准品浓度 (0.001 EU/mL)，以测试SpectraMax i3 读板机的灵敏度。
读板机的温度设置在 37℃，在实验前等待其内部温度升至 37℃。取 100 µL 空白对照和内毒素标准品 ( 3 复孔 ) 加入到微孔板的孔中。该微孔板放置在读板机内 37℃ 孵育至少 10 min。在预孵育过程中，分别以 5:4:1 的比例将荧光基质、检测缓冲液和 rFC 酶溶液混合制备工作液。在预孵育 10 分钟后取 100µL 工作液添加到每个孔。
SpectraMax i3 读板机的温度在实验期间维持在 37℃。使用表一中显示的设置在 0时刻读板 ( 加入工作液后 )。在 SoftMaxPro 软件中设置 PMT 增益值为自动获取，可以确保在不需要确定灵敏度设置的情况下，在整个样本范围内获得准确的结果。初始进行板高优化，优化后的 2 mm 读高用于后续检测。在first读数 (T0) 后,微孔板在读板机内37℃ 孵育 1 小时，然后用同样的设置读取第 2 次。读取-孵育-读取的工作流程可以在SoftMax Pro 软件设置自动读取 ( 图 2 )。在第二次读数后 (T60), 每个标准品使用以下算法计算 ΔRFU：(STDT60-STDT0) ‒(BLT60-BLT0)
• STDT60 是 1 小时时标准品的 RFU
• STDT0 是 0 时刻时标准品的 RFU
• BLT60 是 1 小时时空白对照的 RFU
• BLT0 是 0 时刻时空白对照的 RFU

结果
SpectraMax i3 读板机满足 PyroGene 试剂盒的各种要求，使用 ΔRFU 的 log 值和浓度的 log 值在 SoftMax Pro 软件中绘制标准曲线 ( 图 3 )采用五个梯度的内毒素稀释液 ( 浓度从0.001 EU/mL 到 5 EU/mL ) 进行检测。重复标准的 CV 低于 5%。R2 值为 0.996，标准曲线在这一扩展的浓度范围内显示出良好的线性。SpectraMax i3 读板机能够检测到比产品说明书中建议的范围 ( 0.005EU/mL 到 5.0 EU/mL ) 更低的内毒素浓度，显示其具有更高的荧光检测灵敏度。
总结
标准曲线在低浓度复孔间的变异很小，而且灵敏度低于建议的检测下限，展现了SpectraMax i3 多功能读板机在进行
GyroGene 重组因子 C 检测时具有非常优异性能优势。用 SpectraMax i3x 读板机和其他荧光检测的 SpectraMax 读板机也可以得到类似的结果。
SoftMax Pro 软件可用于分析数据，ΔRFU值用于绘制标准曲线，计算生成 R2，并显示出该读板机在低浓度内毒素检测的灵敏度。