细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法试剂盒说明书

文档简介细菌ATP/ADP/AMP含量GX液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌ATP/ADP/AMP含量GX液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理，碱性中和后，在GX液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP或AMP波峰，以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景腺嘌呤核苷酸（adeninenucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylicacid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylatekinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosinediphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在GX液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。产品内容酸性液（ReagentA）毫升中和液（ReagentB）毫升流相液A（ReagentC）毫升流相液B（ReagentD）毫升标准液（ReagentE）微升产品说明书1份保存方式保存标准液（ReagentE）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（ReagentA）和中和液（ReagentB）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品操作的容器4℃（微型）台式离心机：用于样品操作GX液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定实验步骤样品准备准备好待测细菌样品进行细菌计数：在分光光度仪上测定OD600或直接计数转移到预冷的1.5毫升离心管放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf5415）小心抽去上清液，保留沉淀颗粒加入XX微升预冷的酸性液（ReagentA）涡旋震荡1分钟转移到1.5毫升离心管放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g小心移取上清液到新的1.5毫升离心管加入XX微升中和液（ReagentB），充分混匀置于冰槽里静置30分钟即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测二、测定准备开启仪器预热15分钟根据下表设置GX液相色谱仪（HPLC）参数参数推荐补充说明色谱柱长度：25cm直径：4.6mmWaters仪器或Agilent仪器固定相ODS流动相流相液A（ReagentC）和流相液B（ReagentD）参见运行程序流速1.3毫升/分钟注射容量50微升10微升至100微升检测紫外波长254nm柱温25℃出峰时间（retention）5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)参考运行时间15分钟参考运行程序运行时段程序时间开机后预运行XX流相液A（ReagentC）总10分钟检测运行时段XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）0至9分钟XX流相液A（ReagentC）至XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）至XX流相液B（ReagentD）9至15分钟关机前运行XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）总10分钟标准样品配制准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管分别加入XX微升流相液A（ReagentC）到1至5号管移取XX微升标准液（ReagentE）到1号管，混匀小心移取XX微升1号管稀释的标准液（ReagentE）到2号管，混匀小心移取XX微升2号管稀释的标准液（ReagentE）到3号管，混匀小心移取XX微升3号管稀释的标准液（ReagentE）到4号管，混匀将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号流相液A（ReagentC）标准液（ReagentE）标准ATP/ADP/AMP浓度1XX微升XX微升XX微摩尔/升2XX微升XX微升1号管XX微摩尔/升3XX微升XX微升2号管XX微摩尔/升4XX微升XX微升3号管XX微摩尔/升5XX微升00四、色谱分析将上述配制的标准液（ReagentE）和待测样品放进冰槽里等待每次（每个样品）注射50微升按照检测运行程序每次（每个样品）运行15分钟获得色谱波峰图：波峰面积（peakarea）或峰值，保存记录注意事项本产品为25次操作，包括标准液操作时，须戴手套系统操作过程中，标准液测定只需1次试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜酸性液（ReagentA）和中和液（ReagentB）具有腐蚀性，注意操作安全建议使用流相液A（ReagentC）作为阴性对照或作为基准线色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等用户可以使用已知浓度的标准液（ReagentE）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）腺嘌呤核苷酸的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（ReagentE）实际出峰为准用户可以根据要求，计算实际浓度为：纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下：