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大鼠核转录因子p65(NF-p65)ELISA试剂盒

上海科学仪器有限公司 2018-09-13
文档简介大鼠核转录因子p65(NF-kBp65)ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠NF-kBp65单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的NF-kBp65与单抗结合,加入生物素化的抗大鼠NF-kBp65,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,Z后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,NF-kBp65浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中NF-kBp65浓度。试剂盒组成(2-8℃保存)酶标板(CoatedWells)96孔酶标抗体工作液(EnzymeConjugate)12ml10×标本稀释液(SampleBuffer)12ml20×浓缩洗涤液(WashBuffer)50ml标准品(Standards):20ng/瓶2瓶底物工作液(TMBSolution)12ml**抗体工作液(BiotinylatedAntibody)12ml终止液(StopSolution)12ml准备试剂与收集血样1.收集标本:血清、血浆(EDTA)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存,避免反复冻融。2.标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成20ng/ml的溶液。设标准管8管,**管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。4.洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)标本激活方法1.将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。2.加20ul1NHCI,盖紧,上下混匀。2-8℃放置60±2分钟。3.加20ul1NNaOH,盖紧,上下混匀。4.即用,或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。(注意:不同的标本NF-kBp65的水平可能有较大差异,请根据实际情况灵活掌握稀释度)5.细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液+50ul样本+20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH)。检测程序1.加样:每孔各加入标准品或待测样品(已激活)100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板:同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板:同前。7.每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应NF-kBp65含量,再乘上稀释倍数即可。试剂盒性能1.灵敏度:Z小的NF-kBp65检测浓度小于15pg/ml。2.特异性:可同时检测重组或天然的大鼠NF-kBp65。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性:板内、板见变异系数均小于8.9%。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!
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