荧光显微镜的荧光染色背景太强如何解决

荧光显微镜的荧光染色背景太强如何解决|应用百科

荧光显微镜相比普通光学显微镜有高特异性、高灵敏度等优势，是现代实验室必不可少的工具，而使用荧光显微镜成像拍照，怕的就是出现高强度的荧光染色背景，因为这会降低成像信噪比，导致样品信号不清晰、细节丢失。那么荧光染色背景太强有哪些成因呢？又如何避免呢？

一、环境光导致的背景荧光

阳光是非常大影响的环境光环境光导致荧光显微镜背景荧光增强是很常见的情况，因为环境光没有经过激发滤光片的过滤，所以有可能包含激发光在内的各种波长光，这可能会带来额外的背景荧光和杂散光。暗室成像可降低背景荧光很多老师会用暗室成像，或用衣服/遮光罩把荧光显微镜遮光来成像，这对降低一些背景荧光和杂散光是有意义的，有条件可以参考。

二、透射聚光镜导致的背景荧光

激发光照亮了下光源，带来背景荧光目前使用的荧光显微镜主要是落射荧光显微镜，也就是说，荧光激发光从物镜出来，照射样品，然后发射光回到物镜成像。由于样品玻片是透明的，因此激发光穿过样品后还会进入透射光路的聚光镜，再反射并聚光回样品上，形成强背景荧光。倒置荧光显微镜MF52-N我们以升级荧光观察的正置显微镜明美MF31和倒置显微镜明美MF52-N为例，给大家介绍如何解决这个问题。调整聚光镜前的背景荧光（目镜成像）首先是正置荧光显微镜MF31，在进行调整前，有非常强的同色背景荧光，导致样品信号比较难分辨。聚光镜有限位要先解锁首先下调聚光镜高度，部分机子可能有限位装置，需要先解除限位再下降。把聚光镜光阑收到小，或把牛皮纸之类不反光的纸片，插到聚光镜顶部和载物台之间。调整聚光镜后的背景荧光（目镜成像）可以看到背景荧光得到了大幅改善，这个信噪比足够后期把背景荧光处理掉了。调整聚光镜前的背景荧光（目镜成像）倒置荧光显微镜MF52-N方面，在进行调整前，有偏红的背景荧光和杂散光出现，影响成像纯净度。聚光镜孔径光阑收到小由于倒置显微镜无法调节工作高度，也不方便放置遮光板，因此可以做简单的操作，把聚光镜的孔径光阑收到小，光阑的叶片会阻挡发射光透过，就避免了额外的背景荧光。调整聚光镜后的背景荧光（目镜成像）孔径光阑收小之后，偏红的背景荧光就消失了，样品信噪比得到了改善。

三、来自样品、器皿和介质的背景荧光

上述两种背景荧光，都不会因为样品移动而变化，如果样品移动背景荧光也有变动，那么问题可能就出在样品、器皿或者介质，需要针对性处理。微管中未结合的染料比如样品有未结合的染料，需测试优化合适的荧光染料浓度，并在样品处理时使用PBS多漂洗几次，去除未结合的染料。荧光染料和植物自发荧光一同激发如果样品有自发荧光造成干扰，可能需要尝试其他通道的染料进行标记，另外塑料器皿也可能有背景荧光，建议使用无荧光的玻璃器皿。
MF52-N观察多孔板，塑料有背景荧光如果使用多孔板，可以设置一些不带样品的对照孔来获取背景荧光强度信息，方便后期处理时可以把背景荧光扣除掉。
免疫荧光标记的固定细胞成像，如果出现背景荧光问题，需要检查封片剂，高倍观察的话还要注意镜油是否为无荧光镜油。
好了，以上就是本期对荧光显微镜成像背景荧光强的成因和一些解决方法的介绍，希望对大家的日常实验和实验室管理有帮助。
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