DNA 甲基化的检测方法

一、DNA 甲基化概述

表观遗传学是研究 DNA 序列不发生改变的前提下，基因的表达发生可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰的研究内容包含 DNA 甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA 甲基化是人类最 早发现的表观遗传修饰之一，属于非组蛋白表观遗传现象。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMTs）的催化下，将一个甲基（CH3）基团共价连接到胞嘧啶的 5 号碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）的过程。哺乳动物体细胞的 DNA 甲基化主要发生在 CpG 岛（CpG islands，C 指胞嘧啶，G 指鸟嘌呤，p 指连接 CG 碱基的磷酸）。研究结果表明，基因调控元件（如启动子）的 CpG 岛发生 5mC 修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与 DNA 的结合。因而 DNA 甲基化一般与基因沉默相关，非甲基化一般与基因的活化相关，而去甲基化一般与沉默基因的重新激活相关。

细胞的表观遗传修饰与细胞代谢、癌症、衰老、心血管疾病及神经退行性疾病等多种疾病相关。受环境，疾病，性别和年龄等因素影响，DNA 甲基化水平处于动态的变化过程。不同个体、组织与细胞之间，甚至是同一个体或细胞的不同发育时期，DNA 甲基化的程度和状态都可能存在差异。研究表明，DNA 甲基化在基因调控、蛋白质表达、胚胎发育、细胞分化、X 染色体失活以及疾病和肿瘤的发生、发展等过程中起重要的调节作用。

二、DNA 甲基化的常见检测方法

DNA 甲基化具有重要的生物学功能，科学家们开发了大量的方法检测 DNA 甲基化水平。目前常见的 DNA 甲基化测定方法包括以下几类：

1. 基因组甲基化水平的分析方法：

包括高效液相色谱（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPCE）。

2. 候选基因甲基化分析方法：

包括甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亚硫酸盐测序法（Bisulphite Sequencing）、甲基化特异性的 PCR（MS-PCR）、甲基化荧光法、焦磷酸测序（Pyrosequencing）、以及结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）等。

3. 基因组范围的 DNA 甲基化模式与甲基化谱方法：

包括限制性标记基因组扫描（RLGS）、甲基化间区位点扩增（AIMS）、甲基化 CpG  岛扩增（MCA）、差异甲基化杂交（DMH）、由连接子介导 PCR 出的 HpaII 小片段富集分析、以及甲基化 DNA 免疫沉淀法等。

三、使用微孔板读板机测定 DNA 甲基化

1. DNA甲基化检测

DNA 甲基转移酶催化甲基基团共价连接到胞嘧啶的 5 号碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC），5mC 是最 早被发现，也是研究最多的修饰碱基，在基因表达调控、生物生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳动物胚胎干细胞和人、小鼠脑细胞中表达的一种修饰，它可以把胞嘧啶羟甲基化。DNA 甲基化水平是一个 DNA 甲基化和 DNA 去甲基化的动态调控的过程。研究结果表明，5mC 可以导致基因沉默或基因表达水平降低，而 5hmC 作为去甲基化过程的第 一步，会导致基因激活或基因表达水平升高。分析 5mC 和 5hmC 在不同细胞和基因组不同区域的含量和比例，对于确认健康和疾病的细胞/组织中的甲基化修饰变化具有重要意义。高效液相色谱法（HPLC）， 薄层色谱法（TLC）和质谱等基于层析的技术都可以被用来检测 5mC 和 5hmC，但是它们步骤复杂，耗时，且成本较高。

利用微孔板读板机（酶标仪）进行 DNA 甲基化相关实验测定灵敏度高，特异性好，并且整个操作步骤简易，快速。可以利用 Molecular Devices 酶标仪，结合 DNA 甲基化检测分析试剂盒，通过光吸收法或荧光法定量检测不同样本的甲基化 DNA（5mC）和羟甲基化 DNA（5hmC）。

2. DNA 甲基转移酶检测

DNA 甲基化是表观遗传学的重要部分，DNA 甲基化模式的改变会导致肿瘤及多种疾病的发生，例如在很多肿瘤中都发现 DNA 甲基转移酶（DNMTs）的表达异常。对 DNA 甲基转移酶的研究不仅可以揭示 DNA 甲基化对基因表达调控的机制，对肿瘤等疾病的治 疗也具有潜在意义。

作为甲硫氨酸的活性形式，s-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl-methionine，SAM）在生物体内的各种代谢过程中起重要作用，参与催化人体内多种不同甲基转移酶，并且与多种甲基转移酶的活性密切相关。SAM 作为甲基供体，在甲基转移酶的催化作用下，可以将甲基基团转移到相应底物上，随后生成 s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosyl-l-homocysteine，SAH）。甲基转移酶通用酶活评价分析方法就是利用这一特性，通过检测 SAH 的含量变化，从而评估催发反应中甲基转移酶的活力和反应效率等。

Elisa 作为传统的方法，存在实验步骤多，需要经过多次洗板、加样、显色等操作步骤，耗时长，结果不稳定等不足。可以利用 Molecular Devices 酶标仪，结合均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）的方法检测甲基转移酶，这种检测方法适合几乎所有甲基转移酶和底物的检测，操作步骤简单、灵敏度高且无放射性污染。

优势

• 拥有 HTRF 兼容性认证，确保仪器性能 

• 高度稳定、均质的高通量检测 

• 使用 SoftMax Pro 软件更快地获得结果

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