简化复杂的荧光多孔板检测方法

细胞凋亡或程序性细胞死亡发生在生物体胚胎发育过程中以清除不需要的细胞，或者发生在成年人的愈合过程中，以消除身体的受损细胞，帮助预防 癌症。用多孔板进行的Caspase检测实验使研究人员能够研究细胞凋亡的早期阶段。在这篇文章中，我们展示了MICA如何与荧光多孔板测定一起应用，以提供100%时空相关性的数据，并将串扰降至最 低。

U2OS细胞在加入细胞凋亡诱导剂星形孢菌素后，在13小时延时成像过程中拍摄标记了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的图像。 

荧光检测的基础知识

多孔板对于需要更高通量的实验非常有用。它们能让用户收集384、96或24个不同的平行实验（或样品）的数据[1]。现代检测试剂盒通常用荧光探针或染料来标记感兴趣的蛋白，然后再用荧光显微镜对每个孔板中荧光标记的样品进行分析[2,3]。高通量的荧光多孔板检测在神经科学、癌症研究和发育生物学等领域的很多实验中都有广泛的应用。幸运的是，许多这类荧光检测的试剂盒在市场上可以买到，这有助于大大简化样品制备，为用户节省大量的时间和精力。

细胞凋亡和Caspase蛋白

细胞凋亡或程序性细胞死亡发生在生物体胚胎发育过程中以消除不需要的细胞，或在成年人的愈合过程中消除身体的受损细胞，帮助预防 癌症[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一个大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的启动和执行中起着重要作用[5,6]。启动型caspases帮助启动细胞凋亡，而执行型caspases进行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是执行者型caspases[5,6,7]。Caspase-3在细胞凋亡过程中有协调细胞结构破坏的作用，而caspase-7有细胞脱离的作用[7]。

Caspase测定法

Caspase检测可以研究细胞凋亡的早期阶段。在这里，我们研究了caspase-3和capase-7被细胞毒性药物（如星形孢菌素）激活的剂量依赖性。为了消除随机效应，在相同的条件下用不同浓度的一种药物或多种药物的组合，对多个检测样本进行了研究。具有统计学意义的结果通常需要重复实验数次。

Caspase检测中的挑战

Caspase检测获得的主要是caspase激活级联开始时的信息。然而，关于单个细胞的其他形态学或激活反应的问题仍未得到解答。Caspase检测中加入更多的荧光染色剂可以获得更多的信息，例如在凋亡过程中的细胞骨架行为或细胞色素c介导的凋亡小体的组装导致caspase-3和caspase-7切割途径的激活[8]。在caspase检测中要快速收集所有荧光标签的信号，从而实现在规定时间间隔获取整个样本板上的数据，可能是很困难的。其次，很难快速并可靠地分离多达四个荧光标签的信号。最 后，如果数据的获取与caspase活性的检测不是同步的，它们就不直接相关。  

由于这些挑战，在进行caspase测定，特别是在结合额外的标记以获得更多信息时，常常会有一些担忧。激活反应前后和形态学数据可能会丢失或没有时空即位置和时间方面的相关性。另外，荧光标签之间的串扰也会导致对结果的误解。

目前，大量的研究实验室可能没有现成的用于这些检测工作的仪器和显微镜。这个问题通常通过使用多个研究小组和用户的共享设备来解决，但这意味着可能需要很长时间才能获得所需的仪器。

这些挑战可能导致延迟获得重要的、可量化的结果，而这些结果会影响根本性突破和获得新的见解。

MICA介绍

MICA是全场景显微成像分析平台，它将研究人员需要的一切都统一在一个完全可控的、高度灵活的环境中，加速显微镜的工作流程，以便更快地获得有意义的科学结果。通过使用这个显微成像分析平台，您可以从以下方面受益：

• 人人皆享：即使是没有经验的用户也能用MICA轻松设置复杂的检测读数。  

• 包罗万象：MICA拥有不同的成像功能，匹配从细胞群体成像到细胞精细结构成像，也可以实现长时间活细胞动态监测。FluoSync技术能同时对4个标记进行成像，具有100%的时空相关性

• 极 致简化工作流程：MICA对4个标记的同时采集以及后续AI驱动的数据分析都显著减少了工作流程步骤。  

方法

MICA用于荧光多孔板检测来研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（图1）。制备U2OS细胞相关样品，最 后用星形孢菌素处理以诱导细胞凋亡。本实验有多个与凋亡早期阶段相关的读数。

结果

图1结果显示了星形孢菌素诱导的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是应力纤维的形成和线粒体膜电位的耗尽。

图1：图中显示了实验工作流程和caspase检测的结果。

用MICA实现了4种荧光标记物的绝 对时空相关性，由此可以对凋亡诱导的早期进行监测（参考视频1和图2）。观察到应力纤维的形成与caspase-3和caspase-7激活开始时线粒体膜电位的丧失相吻合。DNA凝结直接跟随caspase激活。

图2：同一数据集，每列显示单个时间点，每行显示单个标记。

图3为传统宽场显微镜和MICA的时空多色采集对比。荧光标记的同步检测在研究线粒体动力学时，消除了观察线粒体结构和膜电位时的时空伪影。使用传统宽场成像时，由序列采集产生的时空伪影会使测量结果失真，并影响结构和功能的相关性。MICA的FluoSync技术能同时采集并确保时空相关性，采集时没有伪影，膜电位与线粒体结构正确相关。

图3：MICA的HC PL APO 63x/1.2 W motCORR CS2物镜在宽场模式下拍摄的用MitoTracker™绿色（青色）和四甲基罗丹明乙酯（TMRE，品红）染色的U2OS细胞图像。A) 序列采集MitoTracker™绿色通道和TMRE通道，其中裁剪图像显示由于序列采集两个通道之间出现了时空偏移。B）同时采集MitoTracker™绿色通道和TMRE通道，裁剪的图像显示两个通道之间没有任何时空偏移。两个通道保持共定位，并能够对每个MitoTracker™绿色结构（线粒体结构）中的TMRE信号（线粒体膜电位）进行量化测量。比例尺为5µm。

与传统的宽场显微镜不同的是MICA FluoSync[10]可以同时进行4色标签成像、宽光谱检测和拆分[9] （参考图4）。

图4：A) 传统宽场4色荧光成像使用带通荧光滤片：结果是染料分离度差，导致定位精度低，切断信号式减少串扰，序列成像慢。B) 带FluoSync技术的MICA可以同时进行4个标签的成像，宽光谱检测和拆分[9]进行真正的染料分离，以及4倍的同时成像速度。

参考资料：

1. C. Gilbrich-Wille, Consumables for Laser Microdissection: The right solution for every application, Science Lab (2015) Leica Microsystems. 

2. W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems. 

3. W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems. 

4. C.P. Austin, Apoptosis, National Human Genome Research Institute (NHGRI), National Institutes of Health (NIH).

5. R. Jan, G.-e-S. Chaudhry, Understanding Apoptosis and Apoptotic Pathways Targeted Cancer Therapeutics, Adv. Pharm. Bull. (2019) vol. 9, iss. 2, pp. 205-218, DOI: 10.15171/apb.2019.024.

6. S. Elmore, Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death, Toxicologic Pathology (2007) vol. 35, iss. 4, pp. 495–516, DOI: 10.1080/01926230701320337.

7. J.G. Walsh, S.P. Cullen, C. Sheridan, A.U. Lüthi, C. Gerner, S.J. Martin, Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases, PNAS (2008) vol. 105, no. 35, pp. 12815-12819; DOI: 10.1073/pnas.0707715105.

8. S. Cullen, S. Martin, Caspase activation pathways: some recent progress, Cell Death Differ. (2009) vol. 16, iss. 7, pp. 935–938, DOI: 10.1038/cdd.2009.59.

9. F. Cutrale, S.E. Fraser, A New Method for Convenient and Efficient Multicolor Imaging: Interview, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

10. FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.